1、书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准?鸭病毒性肠炎检疫技术规范?发布?实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书前言本标准按照 给出的规则起草。本标准参考了世界动物卫生组织（）发布的 陆生动物诊断试验和疫苗手册（版）中 章关于鸭病毒性肠炎的有关内容而制定：修改采用了 发布的 陆生动物诊断试验和疫苗手册 中病毒分离鉴定、方法、微量血清中和试验的技术要求；增加了 发布的 陆生动物诊断试验和疫苗手册 中没有提及的荧光 检测方法、直接荧光抗体试验、间接酶联免疫吸附试验。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准的起草单位：中华人民共和国吉林出入境检验检疫局、中华人民共和国天
2、津出入境检验检疫局。本标准主要起草人：孟日增、石建平、王建华、肖成蕊、王伟利、王振国、刘晶。犛 犖犜 鸭病毒性肠炎检疫技术规范范围本标准规定了鸭病毒性肠炎的病毒分离与鉴定、方法、荧光定量 方法、免疫荧光试验、微量中和试验、等操作规程及技术要求。本标准适用于鸭、鹅等水禽及天鹅（雁形目）鸭病毒性肠炎的诊断与检疫。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。分析实验室用水规格和试验方法概述鸭病毒性肠炎（）又称鸭瘟（），该病是由疱疹病毒科鸭瘟病毒引起的一种急性（有时呈慢性）鸭、
3、鹅和天鹅（雁形目）接触性传染病，其特征为体温升高，两腿麻痹，下痢，流泪和部分病鸭头颈肿大。食道粘膜有小出血点，并有灰黄色假膜覆盖或溃疡，泄殖腔粘膜充血出血水肿和假膜覆盖。肝有不规则大小不等的出血点和坏死灶。本病传播迅速，发病率和病死率都很高，严重地威胁养鸭业的发展。鸭病毒性肠炎的诊断方法包括临床综合诊断、病原学诊断、血清学试验和分子生物学检测。诊断技术 临床综合诊断 临床症状自然感染的潜伏期一般为，鸭群突然出现持续性高死亡率，病初体温升高（以上），呈稽留热。这时病鸭表现精神萎顿，头颈缩起，食欲减少或停食，渴欲增加，羽毛松乱无光泽，两翅下垂，两脚麻痹无力、走动困难，流泪和眼睑水肿是鸭瘟的一个特征
4、性症状。同时病鸭下痢，排出绿色或灰白色稀粪，泄殖腔粘膜充血，出血水肿严重者粘膜外翻。用手翻开肛门时，可见到泄殖腔粘膜有黄绿色的假膜，不易剥离。成年鸭死亡时膘情良好，死亡的鸭阴茎脱垂明显；产蛋鸭群在死亡高峰期产蛋明显下降；周龄周龄商品雏鸭表现脱水、消瘦，喙发蓝，结膜炎、流泪、鼻腔有渗出物和泄殖腔有血染等特点。自然条件下鹅感染鸭瘟，其临床特点与鸭相似。病理学检查鸭瘟眼观变化见败血症的病变，体表皮肤有许多散在出血斑，眼睑常粘连分泌干酪样物覆盖。部分头颈肿胀的病例，皮下组织有黄色胶样浸润。食道粘膜有纵行排列的灰黄色假膜覆盖或小出血斑点，假膜易剥离，剥离后食道粘膜留有溃疡斑痕，这种病变具有特征性。肠粘膜
5、充血出血，以十二指肠和直肠犛 犖犜 最为严重。泄殖腔粘膜表面覆盖有一层灰褐色或绿色的坏死结痂，不易剥离，粘膜上有出血点和水肿。产蛋母鸭的卵巢滤泡增大，有出血点和出血斑，有时卵泡破裂，引起腹膜炎。雏鸭感染鸭瘟病毒时，法氏囊呈深红色，表面有针尖状的坏死灶，囊腔充满白色的凝固性渗出物，这些病变具有诊断意义。组织学变化，以血管壁损伤为主，小静脉和微血管明显受损，管壁内皮破裂。具有特征性组织学变化，见坏死的肝细胞发生明显肿胀和脂肪变性，肝索结构破坏，中央静脉红细胞崩解，血管周围有凝固性坏死。肝细胞见有核内包涵体。脾窦充满红细胞，血管周围有凝固性坏死。食道和泄殖腔粘膜上皮细胞坏死脱落，粘膜下层疏松，水肿，
6、有淋巴样细胞浸润。胃肠粘膜上皮见有核内包涵体。结合临床症状与病理学检查，可对本病作出初步诊断。病毒分离与鉴定 材料和试剂 器材细胞培养瓶（或培养板）、吸管、移液器、二氧化碳培养箱、冷冻高速离心机、研磨器、倒置显微镜、玻璃滤器、孔径 微孔滤膜。水符合 中一级水要求。试剂胰酶消化液、细胞生长液、细胞维持液、双抗液分别见附录、。实验动物日龄易感雏鸭、日龄 日龄 鸭胚。细胞原代鸭胚成纤维细胞（细胞）、原代鸭胚肾细胞（）。病毒分离培养 样品采集和运送 样品采集在发病早期，无菌采集病鸭血液或刮取口腔伪膜及溃疡处粘液；在动物死亡后，无菌采取肝、脾、肾组织样品。运送及保存条件立即进行实验室检测的样品，保存于
7、或置于冷藏盒中快速送达，不能立即检测的样品置于 以下条件冷冻保存待检。样品制备血液样品应分离出血清或血浆，作为接种材料。组织样品（肝、脾、肾），加入无血清细胞培养液，制成 悬液，离心 ，吸取上清液，加入双抗溶液，作用（样品确定未污染可不加双抗溶液处理）后备用。污染较为严犛 犖犜 重的样品或可疑受污染的样品，应用 的微孔滤膜进行过滤处理后作为接种材料。病毒分离方法 接种实验动物法选取日龄易感雏鸭 只，分成两组。一组用 中制备的接种材料进行肌肉接种，每只 ，另一组用同一剂量的无血清细胞培养液，隔离饲养作对照组。接种后逐日观察，连续观察 。若对照组与接种组均无异常表现，可判定为病毒分离阴性；若对照组
8、正常，接种组出现 中临床表现或死亡病例，立即进行剖检检查，剖检可见 与 中的病变，可收集病料进行病毒鉴定。细胞培养法按照常规方法制备 单层细胞（可参照附录），将制备好的样品接种于 孔细胞培养板培养的原代细胞单层，每份样本至少接种孔，每孔 ，吸附，倾去多余液体，加入 营养液，放入 的二氧化碳恒温培养箱中培养。设正常细胞对照至少孔。样品接种 后，于倒置显微镜下逐日观察细胞病变并作好相应记录，若细胞对照孔正常，而接种样品孔出现细胞变圆、聚堆成簇或由于细胞脱落形成空斑等细胞病变现象时，冻融次后转入新长满单层的细胞培养板，如果观察仍出现类似细胞病变，且日渐明显，则可收获细胞培养物，放入 冰箱中待鉴定。如
9、果对照细胞与接种样品细胞均无变化，再盲传两代。盲传过程中若出现细胞病变，按上述原则，收获细胞培养物，放入 冰箱中待鉴定；若未出现细胞病变，则按未分离到鸭瘟病毒出具结果。鸭胚分离法将 中处理好的待接种样品无菌接种于至少 枚日龄 日龄种鸭胚的绒毛尿囊膜上，以后在暗室内逐日照胚观察鸭胚死亡情况并记录，弃去 内死亡鸭胚，检查 内死亡的鸭胚，若呈现特征性的弥漫性出血，收集绒毛尿囊膜（）待鉴定。若胚体未死亡或死亡胚体无明显病变，则将 悬液盲传两代，继续观察胚体死亡及病变情况，并收集 及尿囊液进行病毒鉴定。病毒鉴定用 方法（见）、荧光定量 方法（见）和直接荧光抗体试验（见）进行病毒鉴定。进行病毒分离与鉴定时
10、，要求所有样品处理应于可保证生物安全的相应级别实验室内进行操作；处理样品使用过的容器、物品、实验材料均应经有效消毒处理后方可运离实验室。犘 犆 犚方法 试剂与材料 参考毒株：株，由指定单位提供。犜 犪 狇酶：，保存于，避免反复冻融或温度剧烈变化，随用随取。倍 缓冲液：浓度 。混合液：含 、四种脱氧核苷酸。蛋白酶：浓度为 。引物：本试验选用保守性和特异性均好的指导 聚合酶合成的基因（区）序列作为 扩增区，设计两条引物、。引物位置和序列如下：（）（）犛 犖犜 、引物扩增片段为 。其他试剂 碱、苯酚、氯化钠、盐酸、乙醚和乙醇等均为市售分析纯。器材和设备 扩增仪、电泳仪、微量移液器用吸头、凝胶成像分析
11、仪、恒温培养箱、普通冰箱、低温冰箱、组织匀浆器或研磨器、灭菌离心管、离心机等。操作方法 样品采集与处理 样品采集发病可疑动物采集血液或口腔、泄殖腔拭子样品，保存于或置于冷藏盒中；死亡动物无菌采集肝、脾、肾等组织样品；胚体采集绒毛尿囊膜或收集尿囊液；细胞培养物冻融后收获。样品处理组织样品需用 的 按质量浓度配制成 悬液，匀浆或研磨，冻融次，离心 ，收集上清液备用。拭子样品充分洗脱后，离心 ，收集上清液备用。全血、尿囊液、细胞培养物等液状样品直接用于检测。对照样品制备 阳性样品：将病毒 株接种于长满单层的原代 细胞（或原代 细胞），吸附后加入维持液，置二氧化碳培养箱 培养，逐日观察，待细胞病变（）
12、达到约 时收获病毒悬液，小瓶分装，每瓶，置 保存备用。阴性样品：原代细胞培养物。病毒犇 犖 犃抽提 将 中分离样品或 中处理好的 待测样品液加到 离心管中，以 犵离心，沉淀病毒。弃去上清液，用 缓冲液重悬沉淀物。加 蛋白酶，终浓度为，充分混合，置 温箱。加入 ，终浓度为，充分混合，。加入 氯化钠，终浓度 ，充分混合。加 （用 ）平衡的新鲜苯酚，颠倒混合 次。犵离心 ，将上层水相（样品）转移到一个新管中。重复步骤 和 中苯酚抽提步骤一次。管中加入 乙醚，充分混合，犵离心 。弃去上层水相（乙醚），重复乙醚抽提（步骤 ）一次。打开管盖，放置 ，或到闻不到乙醚气味。将管中内容物分成两部分，每管加入 倍
13、样品体积的 乙醇，颠倒管子数次以混合管中内容物，室温放置 。犛 犖犜 犵离心 ，弃去上清液。加入 乙醇轻轻洗涤沉淀，然后 犵离心 。弃去上清液，打开管盖 放置 干燥沉淀。加入 无 酶和 酶的超纯水重悬。样品管短期保存待用或 长时间保存。也可用等效的商品化 提取试剂盒制备病毒 样品，操作按说明书进行。犘 犆 犚扩增犇 犖 犃 犘 犆 犚反应液组成见表。表犘 犆 犚反应液组成 倍浓缩缓冲液 引物 引物 犜 犪 狇酶 总体积为，瞬时离心。犘 犆 犚反应程序 ；，个循环；保存。犘 犆 犚产物琼脂糖凝胶电泳用新鲜的 电泳缓冲液配制琼脂糖凝胶（浓度 ）并制板。将琼脂糖凝胶板水平放入电泳槽，使 电泳缓冲液刚
14、好没过胶面。将 产物和上样缓冲液（）混匀后加入样品孔。同时加入 标准分子量对照品（），电泳 ，当溴酚蓝接近底部时终止电泳。紫外灯下观察核酸带并判断结果，或用凝胶成像分析仪分析结果。结果判定标准 阳性对照应出现一条约 的 条带，阴性对照和空白对照没有核酸条带，试验成立。待检样品经电泳出现约 的 条带可判为阳性。待检样品扩增经电泳未出现 条带，或者出现的条带不是 判为阴性。荧光定量犘 犆 犚方法 材料与试剂 仪器与器材荧光 检测仪，台式高速冷冻离心机，振荡器，微量可调移液器（、犛 犖犜 、）及配套的吸头，离心管等。试剂 阳性对照：连有 部分 片段的 载体，由指定单位提供。阴性对照：空白 载体，由指
15、定单位提供。犜 犪 狇酶：，保存于，避免反复冻融或温度剧烈变化，随用随取。倍浓缩缓冲液：浓度为 。混合液：含 、四种脱氧核苷酸。引物本试验选用保守性和特异性均好的指导 聚合酶基因（区）序列中某段设计二条引物、和探针，序列如下：犜 犪 狇 ：（：，：）、引物扩增片段为 。其他试剂 碱、苯酚、氯化钠、盐酸、乙醚和乙醇等均为市售分析纯。操作方法 样品的采集与处理具体参见 。病毒犇 犖 犃抽提具体参见 。荧光犘 犆 犚检测 扩增前试剂准备检测鸭瘟病毒的荧光定量 反应液配制见表。表荧光定量犘 犆 犚反应液配制表名称储备液浓度终浓度加样量缓冲液 上游引物 下游引物 探针 犜 犪 狇酶 水 总体积 犛 犖犜
16、 各种试剂充分混匀，瞬时离心，取犖个（犖个阳性对照个阴性对照狀个检测样品）荧光 反应管，将上述配制好的反应液按每管 进行分装。加样将 中抽提出的 样品以及阳性对照与阴性对照样品各分别加入分装好反应液的荧光 反应管中，盖紧管盖，瞬时离心。荧光犘 犆 犚检测将加好样品的荧光 反应管按顺序放入荧光 检测仪中，并记录摆放顺序，然后设定反应条件。各循环参数见表，在第阶段的延伸时（）收集荧光信号。表荧光犘 犆 犚扩增程序循环阶段循环数温度时间 结果判定 质控标准 阴性对照无 值，并且无扩增曲线。阳性对照的 值应，并且出现典型的扩增曲线。判定标准 当被检测样品无扩增曲线，表明样品中无鸭瘟病毒。当被检测样品有扩增曲线，且 值，表示样品中有鸭瘟病毒。直接荧光抗体试验 材料荧光标记的兔抗鸭瘟 ：由指定单位提供。原代 细胞（或 细胞）、含 和小牛血清细胞营养液、冷丙酮、孔细胞培养板、飞片、磷酸甘油溶液和荧光显微镜等，由实验室自备。操作方法 原代细胞的制备可采用原代 或原代 细胞，制备方法可参照附录进行。飞片的制作将制备好的浓度约为 个 （或 ）细胞悬液加入装有玻璃飞片的孔培养板每孔，放入含二氧化碳的 培养箱
