1、B 1 5.1 1中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准N Y/T 4 0 1-2 0 0 0脱毒马铃薯种薯(苗)病毒检测技术规程Ru l e s f o r v i r u s d e t e c t i o n o f v i r u s-f r e e s e e d(s e e d l i n g)p o t a t o e s2 0 0 0 一 0 9 一 2 2 发布2 0 0 0 一 1 2 一 0 1 实施中华人民共和国农业部发 布N Y/T 4 0 1-2 0 0 0前言 为了有效地实施对脱毒马铃薯种薯质量检验和管理，规范脱毒马铃薯种薯市场，促进马铃薯脱毒技术推广
2、，实现脱毒种薯病毒检测的规范化、标准化，特制定本规程。本规程在参照国内外马铃薯病毒检测技术最新研究进展的基础上，结合当前国内生产实际，力求达到快速、准确、可操作性强的检测要求。检测对象主要选择生产上发生分布范围广、危害 性大的病毒。检测方法主要采用指示植物检测和双抗体夹心酶联免疫吸附 检测方法，而类病毒检测采用指示植物检测、往返电泳或反转录一 聚合酶链反应检测方法。本规程内容包括脱毒马铃薯种薯(苗)病毒检测的适用范围、检测对象、抽样方法、检测方法和质量要求。本标准的附录 A、附录 B、附录C都是标准的附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准主要起草单位:农业部植物脱毒种苗质量监督检验测试
3、中心(济南)、山东省植物保护总站。本标准主要起草人:孙作文、王同伟、商明清、杨勤民、徐鲁、刘敬东。中华人民共和国农业行业标准脱毒马铃薯种薯(苗)病毒检测技术规程N Y/T 4 0 1-2 0 0 0Ru l e s f o r v i r u s d e t e c t i o n o f v i r u s-f r e e s e e d(s e e d l i n g)p o t a t o e s1 范围 本标准规定了脱毒马铃薯种薯、组培苗的病毒检测方法和操作规程。本标准适用于脱毒马铃薯种薯、组培苗的病毒检测。2 引用标准 下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本
4、标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。G B 7 3 3 1-1 9 8 7 马铃薯种薯产地检疫规程 G B 1 8 1 3 3-2 0 0 0 马铃薯脱毒种薯3定义 本标准采用下列定义。3.1 脱毒苗 应用茎尖组织培养技术获得的再生试管苗，经检测确认不带马铃薯x病毒(P V X)、马铃薯Y病毒(P V Y)、马铃薯S病毒(P VS)、马铃薯卷叶病毒(P L R V)等病毒和马铃薯纺锤块茎类病毒(P S TV d)，才确认是脱毒苗。3.2 脱毒种薯 从繁殖脱毒苗开始，经逐代繁殖增加种薯数量的种薯生产体系生产出来的。脱毒种薯 分为基
5、础种薯和合格种薯两类。基础种薯是指用于生产合格种薯的原原种和原种;合格种薯是指用于生产商品薯的种薯。3.2.1 基础种薯(分为三级)3.2.1.1 原原种 p r e-e l i t e 用脱毒苗在容器内生产的微型薯(m i c r o t u b e r)和在防虫网室、温室条件下生产出的符合质量标准的种薯或小薯(rn i n i t u b e r).3.2.1.2 一级原种 e l i t e I 用原原种作种薯，在良好隔离条件下生产出的符合质量标准的种薯3.2.1.3 二级原种 e l i t e II 用一级原种作种薯，在良 好隔离条件下生产出的 符合质量标准的种薯。3.2.2 合格种
6、薯(分为二级)3.2.2.1 一 级种薯 c e rt i f i e d g r a t e I 用二级原种作种薯，在隔离条件下生产出的符合质量标准的种薯。3.2-2.2 二级种薯 c e r t i f ie d g r a t e II中华人民共和国农业部 2 0 0 0 一 0 9 一 2 2 批准2 0 0 0 一 1 2 一 0 1实施 1N Y/T 4 0 1-2 0 0 0 用一级种薯作种薯，在隔离条件下生产出的符合质量标准的种薯。3 病毒病株允许率 脱毒种薯繁殖田中病毒病株的允许比率。检 测对象马铃薯x病毒(P o t a t o v i r u s X,P V X);马铃薯
7、Y病毒(P o t a t o v ir u s Y,P V Y);马铃薯 S病毒(P o t a t o v i r u s S,P V S);马铃薯卷叶 病毒(P o t a t o l e a f r o l l v i r u s,P L R V);马铃薯纺锤块茎类病毒(P o t a t o s p i n d l e t u b e r v i r o i d,P S T V d),抽样组培苗抽样1 脱毒核心材料:每株必须检测。2 扩繁苗:随机抽取 1 0 o-2 0 0 的扩繁苗检测。田间抽样田 间抽样数量及抽样时期应符合G B 1 8 1 3 3-2 0 0 0 中6.2 的规
8、定。商品种薯抽样没有经过田间检验的种薯必须进行块茎检验。1 根据种薯不同存放方式，采用分层设点取样或随机取样法，抽样数量见表 1,表1 抽样数量标准表5515.1515.2种薯总量，k g抽样百分率，%抽样最低数量,k g簇 1 0 0 0 06 1 01 0 0 1 0 0 0 03-5注:不足抽样最低数量的全部作为混合样品。.2 将第一次抽取的样品混合后，进行二次抽样，随机抽取 1 0%的混合样品检测。检测方法指示植物检测法按G B 7 3 3 1-1 9 8 7 中F 4 规定的方法执行。双抗体夹心酶联免疫检测法检测方法见附录A.往返电 泳检测法或反转录一 聚合酶链反应(R T-P C
9、R)检测法用于检测马铃薯纺锤块茎类病毒，检测方法见附录B和附录C,质t要求凡指示植物检测、酶联免疫检测、往返电泳检测或 R T-P C R检测呈阳性反应者为带毒种薯(苗)。各级种薯病株病毒允许率应符合G B 1 8 1 3 3-2 0 0。中第5 章的 规定。N Y/T 4 0 1-2 0 0 0 附录A (标准的附录)双抗体夹心酶联免疫检测法A 1 溶液配制 所用化学试剂为 分析纯级规格，用水为蒸馏水。A l.1 洗涤缓冲液(P B S T,p H 7.4)氯化钠(N a C I)8.0 0 g 磷酸二氢钾(K H 2 P O 4)0.2 0 g 磷酸氢二钠(N a 2H P 0,1 2 H
10、,0)2.9 3 g(或N a 2 H P 0,1.1 5 g)氯化钾(K C I)0.2 0 g 吐温-2 0(Twe e n-2 0)0.5 0 mL 溶于蒸馏水中，定容至1 0 0 0 m l,4 保存A 1.2 抽提缓冲液(P H 7.4)2 0.0 0 g 聚乙 烯A 比 咯烷酮(MWz n o a。一 。)溶于1 0 0 0 m L P B S T中。A1.3 包被缓冲液(p H 9.6)碳酸 钠(N a,C 0,)1.5 9 g 碳酸氢钠(N a H C O,)2.9 3 g 叠氮 钠(N a N O 0.2 0 g 溶于蒸馏水中，定容至1 0 0 0 m L,4 保存。A l.
11、4 封板液 牛血 清白蛋白(或脱脂奶粉)2.0 0 g 聚乙 烯A 比 咯烷酮(M Wz u u。一;。)2.0 0 g 溶于1 0 0 mL P B S T中，4 保存。A 1.5 酶标抗体稀释缓冲液 牛血清白蛋白(或脱脂奶粉)0.1 0 g 聚乙 烯毗咯烷酮(MW-4-0 1.0 0 g 叠氮 钠(N a N,)0.0 1 g 溶于1 0 0 mL P B S T中，4 保存。A 1.6 底物缓冲液 二乙醇胺9 7 m L 叠氮钠(N a N,)0.2 0 g 溶于 8 0 0 m L蒸馏水中，用 2 m o l/I盐酸调 p H至 9.8，定容至 1 0 0 0 mL,4 保存。A1.7
12、 底物溶液(现用现配)0.0 5 g 4-硝基苯酚磷酸盐溶于5 0 m L 底物缓冲 液中。A 2 样品制备 取样品 0.5-1.0 g，加入 5 m L抽提缓冲液，研磨,4 0 0 0 r/m i n离心5 min，取上清液备用A 3 操作步骤A 3.T 包被抗体:每孔加 1 0 0 k L用包被缓冲液按工作浓度稀释的抗体，3 7 0C 保湿孵育 2-4 h或 4 保 3N Y/T 4 0 1-2 0 0 0湿过夜。A 3.2 洗板:用洗涤缓冲液洗板 4 次，每次 3 -5 min,A 3.3 封板:每孔加2 0 0 S L封板液，3 4 保湿孵育 1 一2 h oA 3.4 洗板:同A3.
13、2,A 3.5 包被样品:每孔加 样品1 0 0 p L,3 4 0C 保湿孵育2-4 h 或4 保湿过夜。同时设阴 性、目 标病毒的阳性和空白对照，可根据需要设置重复。A 3.6 洗板:用洗涤缓冲 液洗板4 -8 次，每次3 -5 m i n aA 3.了 包被酶标抗体:每孔加1 0 0 p L 用抗体稀释缓冲液稀释到工作浓度的碱性磷酸酷酶标记抗体.3 7 0 C 孵育 2-4 h,A3.8 洗板:同 A3.2.A 3.9 加底物溶液:每孔加1 0 0 p L,3 7 保湿条件下反应1 h,A l 1 0 酶联检测:用酶联检测仪测定 4 0 5 n m的光吸收值(O D,o,)，记录反应结果
14、。阳。断 T :&ffl ljg pp O D aa,PA,t Xf M 0 D O D a,、2 为 阳 性 附录B(标准的附录)往返电泳检测法B 1 溶液配制 所用化学试剂为分析纯级规格，用水为燕馏水。B 1.1 抽提缓冲液(p H 7.5)三羚甲基氨基甲 烷(T r i s)6.0 6 g 乙二胺四乙 酸(E D T A)1.8 6 g 氯化 钠(N a C D 5.8 4 g 溶于8 0 0 m L蒸馏水中，用盐酸调p H至7.5，定容至1 0 0 0 m L,4 保存。B 1-2 TB E电泳缓冲液(p H8.3)T r i s 1 0.7 8 g 硼酸5.5 0 g EDTA 0.
15、9 3 g 溶于蒸馏水中，定容至1 0 0 0 m L,4 保存。B 1.3 5%聚丙烯酞胺凝胶配方 3 0%丙烯酸胺一 甲 叉双丙烯酞胺储备液(丙烯酞胺:甲 叉双丙烯酞 胺=2 9 0 1)7.5 m L N,N,N,N 一 四甲基乙二胺(T E ME D)原液0.0 4 5 mL 2 0%过硫酸钱(现用现配)0.4 m L 1 O XTB E缓冲液4.5 mL 加燕 馏水至4 5 m L,B 1.4 显影液 氢氧 化钠6.4 0 9 硼氢化钠0.4 0 g 甲醛1.6 m LN Y/T 4 0 1-2 0 0 0 溶于4 0 0 mL蒸馏水中。B l.5 指示染料溶液 4 0 0 o 蔗糖
16、，0.0 3%的二甲苯蓝。B 2 样品制备13 2.1 研磨:取。.5-1.0 g 待检样品，加人 2 mL抽提缓冲液,2 m L用抽提缓冲液饱和的酚、少许十二烷基磺酸钠(S D S),1-2 滴2-疏基乙醇，研磨，同时 设阴 性对照、阳 性对照。B 2.2 离心:加入 2 mL氯仿一 异戊醇(2 4:1)，继续研磨 2 m i n,4。r/mi n 离心1 5 mi n，收集上清液。B 2.3 沉淀:取上清液加入 3 m o l/L醋酸钠使其终浓度为 3 0 0 mm o l/L，并加人 3 倍体积 9 5%的冷乙醇，冰浴1 h,1 0 0 0 0 r/m in 离心 1 5 m i n，收集沉淀抽干。B 2.4 回 溶:取用4 0 0 p L T B E缓冲液溶解沉淀，备用。B 3 往 返电泳B 3.1 制板:取洁净的电泳板，1%琼脂糖封底，制成 5%聚丙烯酸胺凝胶板。B 3.2 加样:取2 0 p L制备好的样品，加人5 I L 指示染料溶液混匀后加入样品槽。B 3.3 第一向电泳:在 3 8 0 V电压下电泳至二甲苯蓝距胶底约 1 c m时停止电泳。B 3.4 第二向电泳:更换
