1、书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准?裂谷热检疫技术规范?发布?实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书前言本标准按照 给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：鱼海琼、鄢志强、林志雄、罗长保、林祥梅、韩雪清、罗琼、田纯见、梁刚。犛 犖犜 裂谷热检疫技术规范范围本标准规定了裂谷热病毒分离鉴定技术、微量血清中和试验方法、酶联免疫吸附试验方法和血凝抑制试验方法的技术要求。本标准适用于裂谷热的检疫。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于
2、本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。出入境动物检疫采样 实验室生物安全通用要求缩略语下列缩略语适用于本文件。：仓鼠肾细胞 ：鸡胚网状组织细胞 ：细胞病变：光密度 ：磷酸盐缓冲液：核糖核酸 ：裂谷热 ：组织培养半数感染量 ：非洲绿猴肾细胞临床诊断根据裂谷热临床症状和发病机理（参见附录）做出初步诊断，确诊还需进行实验室诊断。实验室诊断警告：涉及传染性材料和病毒的部分要严格按照犌 犅 的要求操作。病毒分离和鉴定 材料 荧光显微镜。二氧化碳培养箱。犛 犖犜 细胞培养瓶，孔平底细胞培养板，带盖湿盒。无 抗体胎牛血清，细胞分散液。标准毒株和标准阳性、阴性血清，荧光抗
3、体。细胞或细胞或 细胞。溶液及细胞培养液配制见附录。样品的采集按 规定，逐头进行采样，并按规定填写 送样单 送实验室。采集发热期动物的抗凝血。对怀疑死于该病的动物采集死亡动物的肝脏、脾脏、大脑，流产胎儿。样品的处理血液用常规方法分离血清。死亡动物的肝脏、脾脏、大脑，流产胎儿经剪碎、研磨，加生理盐水，冻融两次，过夜，离心取澄清样品上清液。样品的培养取生长良好，形成 以上单层的细胞，倒去培养液，接种处理好的样品，每瓶接种，每个样品接种个细胞瓶。置 二氧化碳培养箱吸附。倒去样品，加入维持液，二氧化碳培养箱培养。收获病毒，同一样品瓶混和，冻融两次后进行下一步鉴定。样品培养物的鉴定将生长良好的细胞，用细
4、胞分散液处理后，制备成 个 的细胞悬液，加入到 孔细胞培养板内，每孔，置 培养。等细胞生长成 的单层，吸出孔内培养液，接种样品培养物，每孔 ，每个样品个孔。阴性、阳性和空白细胞对照方法同待检样品培养物，每个对照个孔。置 二氧化碳培养箱吸附。吸出各孔内的所加的待检和对照样品，加入维持液，每孔 ，置 二氧化碳培养箱培养。取出细胞板，用 漂洗，自然干燥后，用 预冷的丙酮固定 ，用 洗次，自然干燥。滴加 阳性血清，置 作用。滴加适量免疫荧光抗体，放进湿盒，作用。用 洗次，倾去液体。荧光显微镜镜检。结果判定结果判定如下：阳性对照在显微镜下胞浆呈黄绿色，并见有黄绿色荧光的细小颗粒散布于胞浆内；阴性对照、空
5、白对照无荧光；没有经过阳性抗体作用的细胞荧光较亮，形态清晰，而经过阳性抗体抑制的同一样品无荧光，则判为阳性；犛 犖犜 没有经过阳性抗体作用的细胞荧光微弱，形态不清晰，经过阳性抗体抑制的同一样品无荧光，则重检；重检后仍荧光微弱，形态不清晰，则判为阳性，重检后无荧光则判为阴性；如果阳性对照无特异性荧光或阴性对照出现特异性荧光，则试验失败，应该重检。微量血清中和试验 材料 溶液及细胞培养液配制见附录。本方法使用的阳性血清、阴性血清和被检血清应经过 灭活处理。标准毒株和标准阳性、阴性血清。细胞或细胞或 细胞。无 抗体胎牛血清，细胞分散液。标准细胞培养瓶，孔无菌细胞培养板，、微量可调移液器。倒置光学显微
6、镜。二氧化碳培养箱。种毒繁殖将 标准毒用维持液作 倍稀释，取长成良好单层的细胞，用 洗一次后，接种 病毒，置 作用 ，加入维持液，置 二氧化碳培养箱培养至 细胞出现病变，收获病毒，冻融两次或者超声波裂解，离心 ，取上清液，测定病毒 并分装小瓶，置 冰箱保存备用。病毒的毒价测定将制备的标准病毒抗原，用维持液将其作 倍递增稀释至，每个滴度接种细胞培养板个孔，每孔，随后每孔加入细胞悬液（个）和细胞维持液。同时每板设孔细胞对照。置 二氧化碳培养箱，逐日观察至，记录细胞病变，按 法或 法计算 。中和试验操作程序 血清稀释所有被检血清按要求稀释，每份血清在 孔细胞培养板上做双份，每孔加。阴、阳性对照血清一
7、般稀释个稀释度：，举例：从 至 共孔各加 稀释液，吸取 阳性对照血清加至 孔，吸吹均匀，移 至 孔，依此类推，直到 孔。阴性对照血清同样。工作病毒滴度确认试验病毒工作浓度为 ，按照毒价测定结果确定稀释比例稀释病毒，工作用病毒滴度确认试验是将工作病毒稀释成、，每一稀释度各孔。中和试验吸取病毒工作液 至、孔，其他被检血清孔同样各加。中和，各孔加入适当的细胞悬液 （细胞量为 个），用封口纸或胶布封口，将细胞板置 二氧化碳培养箱培养，并在培养 后观察 。犛 犖犜 结果判定按照病毒滴度确认试验判断病毒的试验剂量，范围内为合理。同时阴性血清对照出现典型细胞病变，阳性血清对照无细胞病变，被检血清对细胞无毒性
8、，细胞对照正常，证明试验成立，可以进行结果判定，否则，试验不成立，复检。判定标准为被检血清同一稀释度 的孔出现完全保护则判为阳性，的孔出现细胞病变时判为阴性。间接酶联免疫吸附试验 材料 溶液配置见附录。标准毒株、标准阳性、阴性血清、无 抗体胎牛血清和辣根过氧化酶标记的 及细胞培养液。细胞或细胞或 细胞。无菌采血，分离血清编号后备用。标准细胞培养瓶，孔酶标反应板，微量可调移液器（）、移液器吸头。酶标仪、二氧化碳培养箱。抗原扩增用 毒株接种 细胞或 细胞或 细胞，加无血清培养基 孵育，刮下并离心细胞，弃去上清液，用差速离心法或密度梯度离心法纯化病毒作为抗原，小瓶分装，或冻干保存。或直接使用基因表达
9、产物。非感染细胞用同样方法处理，制备对照抗原。试验程序 抗原的包被和封闭用包被缓冲液将抗原稀释至工作浓度后，加入酶标板孔内，每孔。将酶标板置于湿盒内于室温（）过夜。洗板弃去孔内溶液，用 洗板次，拍干。加样加入已经稀释的被检血清。每样加孔，每孔。同时设空白（加，样品稀释液）、阴性血清、强阳性血清和弱阳性血清对照。混匀，作用。洗板用 洗板次，拍干。加酶标物加入工作浓度的辣根过氧化酶标记的 ，每孔。混匀，作用。洗板用 洗板次，拍干。犛 犖犜 加底物每孔加入底物溶液 。混匀，置，避光作用 。加终止液每孔加入终止液 。测定犗 犇值于相应波长读取 值。结果判定阴、阳性对照均成立时，用统计学方法计算得阳性血
10、清、阴性血清临界值，根据所测得的样品 值判定结果，值大于或等于阳性血清临界值即判为阳性，值小于或等于阴性血清临界值即判为阴性。介于其间则为可疑。血凝抑制试验 试验材料 病毒抗原。阴、阳性对照血清。无菌采集鹅血液 ，加入等量阿氏液（见附录）中摇匀，置冰箱中保存备用。临用前，洗涤次次，每次 ，将血浆、白细胞充分洗去至上清液清亮，再将沉淀的红细胞稀释成的红细胞悬浮液。无菌采集被检动物血液，离心分离血清，灭活 。灭菌的生理盐水（见附录）。型 孔微量滴定板，微量加样器。试验操作 抗原血凝效价的测定取干净的微量滴定板一块，按表 进行操作。每孔加 生理盐水，孔加抗原，用移液器反复吹打混匀次。吸出 于孔，吹打
11、混匀后吸出 于孔，如此依次稀释到孔，孔 混匀后吸出 弃掉。抗原稀释完后，每孔补加生理盐水。孔、不加抗原，每孔只加生理盐水作空白对照每孔加入的红细胞悬浮液，充分振荡后置于室温，每 观察一次，后判定结果，并作好记录。抗原的血凝滴度是指能使红细胞完全凝集的病毒最高稀释倍数。因此，能使红细胞完全凝集的最高稀释倍数的病毒液 称为个血凝单位（）。如某抗原的血凝滴度是 ，那么 稀释的该抗原 即为个单位。在进行血凝抑制试验时，病毒的工作浓度应为。那么该病毒的工作浓度为，那么 的抗原即含个单位。血凝抑制试验 加生理盐水取干净的微量滴定板一块，按表 进行操作。犛 犖犜 每孔加 生理盐水。加待检血清孔加待检血清，用
12、移液器反复吹打混匀三次；吸出 于孔，吹打混匀后吸出 于孔，如此依次稀释到孔。孔混匀后吸出 弃掉。加对照孔作为阳性血清对照，孔 作为阴性血清对照，孔 不加任何血清而作为抗原对照，孔 不加抗原和任何血清，只加生理盐水作空白对照。加红细胞悬浮液各孔加入红细胞悬浮液，充分振荡后置室温，每 观察一次。未免疫的健康动物血清无凝集抑制作用，各稀释倍数均出现红细胞凝集现象；感染或免疫的动物血清能抑制病毒对红细胞的凝集抑制作用。凡能使抗原凝集红细胞作用完全被抑制的血清最高稀释倍数，称为该血清的血凝抑制价（如附录的血凝抑制价为）。结果判定结果判定如下：判定时应首先观察各对照孔是否完全成立；红细胞凝集：红细胞分散在
13、孔底四周呈均匀的颗粒状凝集且布满整个孔底，判为血凝作用为阳性“”；无凝集或凝集抑制：红细胞集中于孔底中央呈点状，判血凝作用为阴性“”或判血凝抑制作用为阳性；血凝抑制价：凡能使抗原的血凝作用完全受到抑制的最高血清稀释倍数；被检血清的血凝抑制价低于 的血清为阴性，滴度介于 和 的血清为可疑，滴度高于 的血清为阳性；无其他白蛉热血清群病毒感染的国家，滴度低于 判为阴性，至 为可疑，高于 判为阳性。犛 犖犜 附录犃（资料性附录）裂谷热概况犃 地理分布及危害 是一种最急性或急性的人兽共患传染病，流行于非洲反刍动物。本病由布尼病毒科白蛉热病毒属裂谷热病毒引起，只有一个血清型。本病多发于蚊虫活动季节，对绵羊
14、、山羊、牛的危害较为严重，可引起怀孕动物流产和新生畜死亡，大龄非怀孕动物也较易感，但临床抗病性较强。动物的易感性与其本身的遗传差异有关，来自非洲以外及 非流行地区的动物对本病较易感。骆驼对 可发生隐性感染，但流产率和牛一样高。人对 易感，可通过与感染性材料接触或通过蚊虫媒介叮咬感染。在一些动物宿主较少的国家，通过媒介蚊虫叮咬感染人是其显著特征，在这样的地区首先可能会在人群中发现 。可引起实验室工作人员的严重病征，处理病料时应备有高级别生物防护设施。犃 病原学 病毒为一种单一血清型的布尼病毒，隶属白蛉热病毒属，具有布尼病毒的典型形态学和理化特性。病毒核酸位于病毒的核衣壳内，为单股负链，分为（大）
15、，（中），（小）三个片段。片段为双向，即具双向编码性。犃 流行病学 为最急性、急性、发热的人畜共患病，由蚊传播，该病通常在一个国家大面积流行，引起大量孕畜流产和新生畜高死亡率。该病主要发生于绵羊、山羊和牛，不同品种动物对 敏感性差异较大，一些非洲本土动物仅存在隐性感染，外来家畜及有些品种的家畜则表现严重的临床症状，引起死亡和流产。大龄动物及某些品种动物虽然易感，但通常不表现临床症状。在东非和埃及该病流行还影响到骆驼，成年骆驼未见症状，但已见到流产和新生骆驼死亡。犃 临床症状本病无特征性临床症状，个别病例诊断较为困难。疾病流行特征为：众多动物流产，新生畜大批死亡，乃至人群发病。潜伏期较短：羔羊
16、，可产生高达 的双相热，发热一直持续到动物临死前，感染动物精神沉郁、不愿走动、厌食、体表淋巴结可能肿大，腹部疼痛。羔羊发病后于 内死亡。周龄以上动物可能表现最急性死亡或隐性感染。某些病畜表现呕吐，粪便恶臭、黑色或血痢样，流脓性带血鼻液。牛最易表现黄疸，成年牛还可能表现流泪，流涎和泌乳障碍。怀孕绵羊的死亡率和流产率为 不等，牛的死亡率通常不超过。犃 病理变化 对各种家畜肝脏的损伤基本相同，不同年龄的动物表现有差异，最严重的病变在于流产胎儿，犛 犖犜 新生羔羊，其病变为中度至严重肿大、柔软、易脆、黄褐色或暗红褐色、有不规则充血斑、肝实质中存在许多灰白色坏死灶，有时不易识别。成年羊病变较轻，肝实质中可见红色或灰白色针尖样坏死点，胆囊壁常出血或水肿。羔羊除肝病变外，真胃粘膜常有大量小出血斑点，使得小肠和真胃内容物呈巧克力样褐色。所有家畜脾脏和外周淋巴结肿大，水肿，有瘀血点。显微镜检查，人和动物病例最常见的病变是肝坏死。在胎儿或新生牛羊，可见有坏死灶，由密集的细胞和核碎片组成，还有一些纤维蛋白和少量炎症细胞。大部分肝细胞发生严重的崩解性坏死，失去了正常的肝结构。约在 受损肝脏可见嗜酸性卵圆形或杆
