1、长春碱与中心蛋白的结合及其对蛋白聚集性质的影响张文龙1，2*胡颖媛1，2裴科1，2任蕾1杨斌盛3(1山西中医药大学中药与食品工程学院;2山西中医药大学中药炮制山西省重点实验室晋中030619;3山西大学分子科学研究所 化学生物学与分子工程教育部重点实验室太原030006)*联系人，张文龙女，博士，讲师，主要从事生物无机化学研究。E-mail:zhangwl sxtcmeducn山西省自然科学基金项目(201901D211532)、国家自然科学基金项目(81703704)、山西省教育厅基金项目(2020L0416)和山西中医药大学科研基金项目(2020BK09)资助2022-08-12 收稿，2
2、022-09-13 接受摘要通过光谱、等温滴定量热(ITC)以及分子对接等方法研究了八肋游仆虫中心蛋白 N-端半分子(N-EoCen)与长春碱(Vin)之间的相互作用以及 Vin 对 N-EoCen 聚集性质的影响。结果表明，Vin 可以与 N-EoCen 以摩尔比 11结合于 N-EoCen 的第一个 EF-hand 的 F 螺旋与第二个 EF-hand 的 E、F 螺旋之间，条件结合常数约为 104L/mol。复合物的形成是放热的过程，主要依靠静电作用与疏水作用。N-EoCen 与 Vin 结合后，构象发生变化，螺旋含量减少，N-EoCen 与 Tb3+结合能力减弱。最终使得 N-EoCe
3、n 的自聚集以及 Tb3+诱导的聚集减弱。研究结果为蛋白聚集抑制剂的筛选以及相关药物的研发提供了参考和依据。关键词中心蛋白长春碱复合物聚集抑制Binding of Vinblastine to Centrin and Effect on Its Aggregation PropertiesZhang Wenlong1，2*，Hu Yingyuan1，2，Pei Ke1，2，en Lei1，Yang Binsheng3(1College of Chinese Medicine and Food Engineering;2Key Laboratory of Chinese Medicine Pro
4、cessingin Shanxi Province，Shanxi University of Chinese Medicine，Jinzhong，030619;3Key Laboratoryof Chemical Biology and Molecular Engineering of Ministry of Education，Institue ofMolecular Science，Shanxi University，Taiyuan，030006)AbstractThe interaction between vinblastine(Vin)and N-terminal domain of
5、 Euplotes octocarinatus centrin(N-EoCen)was described by spectroscopy，isothermal titration calorimetry(ITC)and molecular docking esultsshowed that Vin could bind between the F helix of the first EF-hand and the E，F helix of the second EF-hand of N-EoCen with a molar ratio of 1 1 stoichiometry in 10
6、mmol/L pH=7.4 Hepes buffer solution at room temperatureThe conditional binding constant is about 104L/mol The binding of Vin to N-EoCen is an exothermic process，mainly relying on electrostatic and hydrophobic interactions The formation of N-EoCen-Vin complex leads to changeof protein conformation an
7、d the decrease of-helix content as demonstrated by circular dichroism(CD)spectra and3D fluorescence spectra The binding ability of Tb3+to N-EoCen is weakened upon complex formation Finally，thebinding of Vin to N-EoCen inhibits the self-aggregation and Tb3+-induced aggregation of protein The results
8、providea reference and basis for the screening of protein aggregation inhibitors and the development of related drugsKeywordsCentrin，Vinblastine，Complex，Aggregation，Inhibit聚集是蛋白质中常见的现象。有些蛋白质的聚集可导致其在生物体中发生纤维化，从而引发各类疾病的产生，例如淀粉样蛋白的异常聚集通常被认为是阿尔茨海默症等淀粉样变性病的主要致病原因之一1;而另外一些蛋白质的聚集则可能具有正向生物学功能，可以控制蛋白的活性，以应对生
9、理和环境的变化，例如 NA 结合蛋白在生理和体外状态的聚集对于维持肠道稳态、个体健康及延缓衰老具有重要意义2。又例如高度寡聚的 S100 蛋白使其在生物体内具有更高的功能363http:/wwwhxtborg化学通报2023 年 第 86 卷 第 3 期DOI:10.14159/ki.0441-3776.2023.03.014效率3。小分子药物可以通过与蛋白质结合来改变蛋白的聚集状态，从而调控蛋白的性质与功能。基于此发掘改变蛋白聚集状态的药物分子是一种独特的药物开发策略。Centrin，与钙调蛋白同属于 EF-hand 钙结合蛋白亚族，是重要的 Ca2+信号通路蛋白。尽管二者属于同一亚族，但由
10、于 Centrin 比钙调蛋白 N 端多含二十几个氨基酸残基，使其具有聚集性质4。Centrin 包含 2 个独立的 EF-hand 结构域，分别为 N 端域和 C 端域，每个域包含一对 EF-hand motif。Centrin 可以通过 EF-hand motif 中loop 环来结合 Ca2+、Tb3+、Mg2+等金属离子5，6，结合金属离子后，构象发生变化，由“closed”变成“open”状态。Centrin 在高浓度时会发生聚集，金属离子(尤其是 Tb3+)的结合会进一步诱导蛋白形成聚集体，N 端域在蛋白的聚集过程中发挥着主要作用7。而 C-端域能够依赖 Ca2+结合靶肽8，与蛋白
11、在细胞内的定位有关。Centrin 普遍存在于各类真核生物中9，与中心体的复制与分离10、mNA 输出11、核苷酸切除修复识别12、光的转导级联13 等密切相关。长春碱(Vin)是从长春花植物中提取的成分，其结构如图式 1 所示。作为一种生物碱，Vin不仅可用于治疗淋巴瘤、乳腺癌和睾丸癌等癌症，还可被应用于阿尔茨海默症、卒中、记忆障碍等情况下的认知障碍的改善以及脑血管疾病的治疗，并且在呼吸系统疾病治疗中也具有潜力14。其优势在于可以通过多靶点调控不同的信号通路，起到抗炎、抗氧化、血管舒张和神经保护等作用。例如，Vin 可以通过阻止微管蛋白聚集或诱导已经形成的微管解聚，影响蛋白质的合成15。图式
12、 1Vin 的结构Scheme 1Chemical structure of vinblastine八肋游仆虫中心蛋白(EoCen)，从单细胞八肋游仆虫中克隆得到16，可以作为一种研究钙结合蛋白性质与功能的模型蛋白。其 N-端域(N-EoCen)共包含 101 个氨基酸残基。前期研究表明，生理条件下，N-EoCen 浓度达到 10mol/L 会发生聚集，形成聚集体。N-EoCen 可以结合 2 个Tb3+，Tb3+的结合会加剧蛋白的聚集7，目前 N-EoCen 的 NM 单体结构(2JOJPDB)和三聚体结构(5Z1QPDB)17 已被解析。鉴于 Vin 的生物学意义，其是否能影响 N-EoC
13、en 的聚集?考虑到这一点，应用多种光谱、量热法、分子对接等技术研究了 Vin 与 N-EoCen 之间的相互作用以及 Vin 对N-EoCen 聚集性质的影响。这一研究提供了 Vin与 centrin 结合的相关信息，对于阐明药物作用机制以及药物的研发具有参考价值。1实验部分1.1试剂Vin(Solarbio 公司);N-2-羟乙基派嗪-N-乙磺酸(Hepes，Sigma-Aldrich 公司)。其他试剂均为市售分析纯级。1.2溶液的配置Vin 溶液:取少量 Vin 固体，溶解于 10mmol/LpH 7.4 Hepes 缓冲液，定容至 10mL，确定其浓度。Tb3+储备液的制备以及 N-E
14、oCen 表达与纯化参考文献 18 完成。1.3荧光光谱荧光光谱使用 F4700 型荧光光谱仪(日本Hitachi 公司)测定，扫描速度为 1200nm/min，狭缝均为 10nm。稳态荧光光谱的扫描范围为 290550 nm，激发波长为 280nm;三维荧光光谱的激发与发射波长均设置为 200 500 nm;Tb3+探针实验:扫描范围为 470650 nm，激发波长为 290nm，使用 360nm 的滤光片;共振光散射光谱(LS)测定:扫描范围为 250600 nm，激发与发射波长相同(=0nm)。1.4等温滴定量热法(ITC)25，利用 MicraoCal ITC200(英国 Malver
15、n公 司)进 行ITC测 试。3.0mmol/LVin、0.07mmol/L N-EoCen 分别置于注射池与样品池中，进行滴定，第一滴滴加 0.4L，以后每次滴加 1L Vin 到样品池中，反应时间为 5min，共滴加 24 次，搅拌速率为 750r/min。实验结果使用仪器自带软件 OriginTM采用“one set of sites”来拟463化学通报2023 年 第 86 卷 第 3 期http:/wwwhxtborg合，数据处理过程中，扣除稀释、混合以及第一次滴定所产生的热量，得到结合常数(Ka)、H与 S。1.5圆二色光谱(CD)25 下，使用法国 Bio-logic Mos 5
16、00 型圆二色谱仪收集，扫描波长范围为 200260 nm，使用光程 1mm 吸收池进行测定，扫描速度为 50nm/min，步长 0.2nm，带宽 1nm。实验测得的数据使用 Dicroprot 软 件 来 分 析，选 择 K2D(neuralnetwork)分析方法进行拟合得到蛋白质的二级结构含量。所有测试均在 10mmol/L pH 7.4 Hepes 缓冲溶液中进行，光谱数据均为 3 次扫描的平均值，数据处理过程中均扣除了稀释效应。1.6分子对接Vin 与 N-EoCen 的结合位点和结合模式通过AutoDock Vina 1.1.2 进行分子对接研究19，选择N-EoCen 结构(PDB 2JOJ)为模版，在整个蛋白质区域内通过全局搜索找出打分最高的结果，即为最适合位点。2结果与讨论2.1N-EoCen 与 Vin 的结合2.1.1荧光光谱由于 N-EoCen 不含色氨酸，仅含有酪氨酸Tyr 残基(Tyr46，Tyr72，Tyr79)，故可使用 Tyr 残基作为其内在荧光来研究蛋白质构象变化和分子间相互作用。图 1(A)是 25 时 10mmol/L pH 7.4 Hepes缓
