1、 1/7 PCR 产物的 TA 克隆(DNA 的胶回收和连接)【实验原理】1.DNA 片段回收方法：DNA 片段在适当浓度的琼脂糖凝胶中，通上一定电压进行电泳，不同大小的 DNA 分子由于迁移率的不同而分离开。切下带有所需 DNA 片段的凝胶，用冻融法、玻璃奶回收法或商品化胶回收试剂盒将目的片段回收纯化。2.利用 Taq 酶能够在 PCR 产物的 3末端加上一个非模板依赖的 A，而 T 载体是一种带有 3T 突出端的载体，在连接酶作用下，可以把 PCR 产物插入到质粒载体的多克隆位点，可用于 PCR 产物的克隆和测序。商品化的 T 载体有很多。本实验采用 TaKaRa 公司的 pMDTM18-
2、T Simple Vector。这个载体以 pUC19 载体为基础，消除了 pUC18 载体上的多克隆酶切位点，经 EcoR酶切后在两侧的 3端添上“T”制备而成（见附录 1）。由于本载体上消除了多克隆酶切位点，克隆后的 PCR 产物将无法使用载体上的限制酶切下，需要在 PCR 扩增引物上导入合适的酶切位点。【试剂与器材】（一）试剂 1.pMDTM18-T Simple Vector Kit（Takara 公司）。2.TAE 电泳缓冲液 3.琼脂糖（Agarose）4.6电泳加样缓冲液：0.25 溴粉蓝，40(w/v)蔗糖水溶液，贮存于 4。2/7 5.溴化乙锭(EB)溶液母液：配制成 10m
3、g/mL，用铝箔或黑纸包裹容器，储于室温即可。6.70%乙醇 7.胶回收试剂盒（Omega 公司）（二）器材 水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机,恒温水浴锅,微量移液枪,微波炉或电炉,紫外透射仪,凝胶成像系统或其它照相设备。【操作方法】（一）胶回收试剂盒回收 PCR 产物（以 Omega 公司 Gel Extraction Kit 为例）1.当目的片段 DNA 完全分离时，转移凝胶至紫外灯上尽可能快地切下目的片段。2.凝胶块转移至 1.5ml 离心管(离心管已经称重了)中，称重得出凝胶块的重量。近似地确定其体积（假设其密度为 1g/ml）。加入等体积的 Binding Buffer（XP2
4、），于 55-65水浴中温浴 7min 或至凝胶完全融化，每 2-3 min 振荡混合物。（在凝胶完全溶解之后，注意凝胶-Binding buffer 混和物的 pH 值。如果其 pH 值大于 8 的话，DNA 的产量将大大减少。如果是橙色或红色，则要加入 5l 浓度为 5 M，pH 为 5.2 的醋酸钠，以调低其 pH 值。该混合物的颜色将恢复为正常的浅黄色。）3.取一个干净的 HiBind DNA Mini 柱子装在一个干凈的 2ml 收集管内（已备好）。4.将第三步获得的 DNA/熔胶液全部转移至柱子中。室温下 10,000 x g 离心 1 分钟。弃收集管中的滤液，将柱子套回 2ml
5、收集管内收集管。5.如果 DNA/凝胶熔液的体积超过 700ul，一次只能转移 700ul 至柱子中，余下的可继续重 3/7 复第 5 步至所有的溶液都经过柱子。每一个 Hibind DNA 回收纯化柱都有一个极限为 25g DNA 的吸附能力。如果预期产量较大，则把样品分别加到合适数目的柱子中。6.弃收集管中的滤液，将柱子套回 2ml 收集管内收集管。转移 300l Binding Buffer（XP2）至柱子中，室温下，10,000 x g 下离心 1min。7.弃收集管中的滤液，将柱子套回 2ml 收集管内收集管。转移 700l SPW Wash buffer（已用无水乙醇稀释的）至柱子
6、中。室温下 10,000 xg 离心 1min。（浓缩的 SPW Wash Buffer在使用之前必须按标签的提示用乙醇稀释。如果 DNA 洗涤缓冲液在使用之前是置于冰箱中的，须将其拿出置于室温下）。8.重复用 700l SPW Wash buffer 洗涤柱子。室温下 10,000 xg 离心 1min。9.弃收集管中的滤液，将柱子套回 2ml 收集管内收集管。室温下,13,000 x g 离心 2 min 以甩干柱子基质残余的液体。10.把柱子装在一个干凈的1.5ml离心管上，加入1530l（具体取决于预期的终产物浓度）的 Elution Buffer(或 TE 缓冲液)到柱基质上，室温放
7、置 1min,13,000 xg 离心 1min 以洗脱DNA。第一次洗脱可以洗出 70-80%的结合 DNA。如果再洗脱一次的话，可以把残余的DNA 洗脱出来，不过那样的浓度就会较低。（二）连接反应（以 Takara 公司 pMDTM18-T Simple Vector Kit 为例）1）在微量离心管中配制下列 DNA 溶液，全量为 5 l。pMDTM18-T Simple Vector 1 l Insert DNA 0.1 pmol0.3 pmol dH2O up to 5 l 4/7 2）加入 5 l（等量）的 Solution I。3）16反应 30 分钟。（2 kbp 以上长片段 P
8、CR 产物进行 DNA 克隆时，连接反应时间请延长至数小时）。4）全量（10 l）加入至 100 l 感受态细胞中，冰中放置 30 分钟。5）42加热 45 秒钟后，再在冰中放置 1 分钟。6）加入 890 l LB 培养基，37振荡培养 60 分钟。7）在含有 X-Gal、IPTG、Amp 的 LB 琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。8）挑选白色菌落，鉴定载体中插入片段的长度大小。【注意事项与提示】1.使用新鲜的电泳缓冲液 TAE Buffer。不要重复使用，其 PH 的升高会减少产量。2.不论采取何种方法回收 DNA，在回收过程中，要尽量减少洗脱体积，以便提高收得率和浓
9、度，以方便后续操作。3.从胶上回收 DNA 时，应尽量缩短光照时间并采用长波长紫外灯(300-360nm)，以减少紫外光对 DNA 的切割。DNA 曝露在紫外灯下不能超过 30 秒。4.连接反应时间是与温度密切相关，因为反应速度随温度的提高而加快。通常可采用 16连接 4 小时为宜，如是平端连接需要适当延长反应时间以提高连接效率；在选择反应的温度与时间关系时，也要考虑在反应系统中其他因素的影响。5.连接反应的整个过程应注意枪头的洁净以避免造成对酶的污染，为防止酶活性降低，取酶时应在冰上操作且动作迅速。7.5/7 6.连接反应应在 25以下进行，温度升高较难形成环状 DNA，影响连接效率。长片段
10、 PCR产物（2kb 以上）进行连接时，连接反应时间应延长至数小时。7.进行克隆时，Vector DNA 和 Insert DNA 的摩尔数比一般为 1:210。根据实验情况选择合适的摩尔数比。8.用高效的感受态细胞（转化效率1108 cfu/g pUC19），这样才可能得到比较理想的阳性克隆。9.试剂盒配有 Control DNA。通过对照实验判断试剂盒的保存效果。【实验安排】第一天下午：配制 6电泳加样缓冲液、TAE 等缓冲液，将各种耗材灭菌。第二天上午：制备琼脂糖凝（1%），电泳检测，切胶回收 DNA 片段 第二天下午：大肠杆菌制备感受态细胞；DNA 与 T 载体连接转化大肠杆菌。第三天上午：观察转化结果（蓝白斑情况），计算重组率。【实验报告要求与思考题】1PCR 产物的 T-vector 克隆方法，应注意哪些操作环节？6/7 2和其他组结果比较，对本组实验结果进行分析。3对于用高保真 Taq DNA 聚合酶扩增的 PCR 产物，如何进行克隆？附录 1：附录 2：7/7
