1、9-1131-07网络首发时间：2 0 2 3-0 6-0 92023,53(09):1131-1137中国兽医科学2023,53(09)ChineseVeterinarySScienceD0I:10.16656/j.issn.1673-4696.2023.0150中图分类号：S852.659.4文献标志码：A文章编号：16 7 3-46 96（2 0 2 3)0蓝舌病毒1型灭活疫苗的制备与免疫效果车永军1,丁晓攀1,张忠辉1,高闪电1,田占成1,刘光远1，罗建勋，关贵全1，常惠芸1，殷宏1,2*,独军政1*（1.中国农业科学院兰州兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室，甘肃封兰州730046;
2、2.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏扬州225009)摘要：比较了二乙烯亚胺(BEI)、甲醛和-丙内酯(BPL)3种灭活剂对蓝舌病毒1型(BTV-1)的灭活效果，利用免疫印迹法检测灭活病毒蛋白，选择BEI作为疫苗灭活剂制备BTV-1灭活疫苗并免疫绵羊，通过竞争ELISA法和噬斑减少中和试验（PRNT)测定抗体效价评价疫苗免疫效果。结果显示,BEI、BPL 和甲醛均能在48 h内完全灭活BTV-1,且在BPL和BEI灭活处理的病毒样品中均可以检测到VP6、VP7、NS1和NS2四种病毒蛋白,而在甲醛处理的病毒样品中仅检测到了VP7蛋白,表明BEI和BPL在灭活病毒过程中对病毒
3、蛋白抗原影响较小。血清抗体检测显示,与对照组相比，疫苗免疫组绵羊血清中抗BTV非中和抗体和中和抗体均显著升高。本研究制备的BTV-1灭活疫苗具有很好的免疫原性，这也为研制其他血清型蓝舌病疫苗奠定了基础。关键词：蓝舌病毒1型；病毒灭活剂；竞争ELISA；噬斑减少中和试验Preparation and immune effect of inactivated bluetongue virustype 1 vaccineCHE Yong-jun,DING Xiao-pan,ZHANG Zhong-hui,GAO Shan-dian,TIAN Zhan-cheng,LIU Guang-yuan,LUO
4、 Jian-xun,GUAN Gui-quan,CHANG Hui-yun,YIN Hong-*,DU Jun-zheng*1*(1.State Key Laboratory for Animal Disease Control and Prevention/Lanzhou Veterinary Research Institute,ChineseAcademy of Agricultural Sciences,Lanzhou 730046,China;2.Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control ofImportant A
5、nimal Infectious Diseases and Zoonoses,Yangzhou 225009,China)Abstract:We compared the inactivation effect on bluetongue virus type 1(BTV-1)by three inacti-vating agents including binary ethyleneimine(BEI),formaldehyde and-propiolactone(BPL).The inacti-vated viral proteins were confirmed by Western-b
6、lot,and BEI was selected as an inactivating agent toprepare inactivated BTV-1 vaccine and then immunize sheep.The antibody titers were tested by competi-tive ELISA and the plaque reduction neutralization test(PRNT)for evaluating the immune effect of thevaccine.The results showed that BEI,BPL and for
7、maldehyde inactivated completely BTV-1 within 48 h,andBTV VP6,VP7,NS1 and NS2 proteins were detected in both BPL and BEI inactivated virus samples,but VP6,NS1 and NS2,except for VP7 protein,were not detected in the formaldehyde inactivated virus samples,which indicated that the BEI and BPL had littl
8、e or no effect on the viral proteins during inactivationof the virus.Serum antibody tests showed that both non-neutralizing and neutralizing anti-BTV anti-收稿日期：2 0 2 3-0 3-16；修回日期：2 0 2 3-0 4-2 5基金项目：国家重点研发计划项目（2 0 2 1YFD1800500)；中央级公益性科研院所基本科研业务费项目（16 10 312 0 2 10 14)；甘肃省基础研究创新群体项目（2 2 JR5RA024）；甘
9、肃省科技厅项目（2 2 CX8NA011）；国家肉牛牛产业技术体系项目(CARS-37)；农业科技创新工程项目（CAAS-ASTIP-2016-LVRI）作者简介：车永军(1995-)，男，甘肃古浪人，研究实习员，研究方向为兽医微生物及其分子生物学,E-mail:。*通讯作者：殷宏，研究员，E-mail:；独军政，研究员，E-mail:。1132第53 卷中国兽医科学bodies were significantly increased after immunization,compared with that of the control group.TheBTV-1 inactivated
10、 vaccine prepared in this study has strong immunogenicity,which also lays a founda-tion for the development of other BTV serotype inactivated vaccines.Key words:bluetongue virus serotype l;viral inactivating agent;competition ELISA;plaquereductionneutralizationtest*Corresponding authors:YIN Hong,E-m
11、ail:;DU Jun-zheng,E-mail:蓝舌病毒(Bluetonguevirus,BTV)是呼肠孤病毒科（Reoviridae)环状病毒属（Orbivirus)的成员，它可以感染绵羊、山羊、牛和鹿等反台动物，目前已发现至少2 9种血清型，不同血清型之间不能形成交叉免疫保护。库螺（Culicoides)为BTV的传播媒介，病毒可在媒介昆虫体内复制并长期存活。BTV对绵羊有较高的致死率，牛和山羊感染后通常在一定时间内携带病毒而没有明显的临床症状，但库螺叮咬带毒动物后能够将病毒传染给其他反动物1-2 。动物感染BTV后，常常出现体温升高、精神沉郁、食欲下降，口腔黏膜水肿、舌肿胀并呈蓝色发进
12、而导致吞咽困难和流涎，有的动物蹄冠和蹄叶发炎，甚至出现跛行。孕畜感染BTV后可发生流产、胎儿脑积水或先天性畸形。该病的暴发和流行经常造成家畜生产性能下降、流产及死亡等直接经济损失，同时影响畜产品正常的进出口贸易进而造成间接经济损失。世界动物卫生组织(WOAH)将其列为必须通报的动物疫病，我国目前将其列为二类动物传染病3-4BTV粒子呈二十面立体对称，无囊膜,其基因组由10 个节段的线性双链RNA(S1S10)组成，全长约19.2 kb,共编码7 种结构蛋白(VP1V P7)和4种非结构蛋白（NS1、NS2、NS3/NS3A 和NS4）。BTV具有双层衣壳，外层衣壳由VP2和VP5蛋白组成，约占
13、病毒总蛋白的40%；内层衣壳由VP3、VP7蛋白组成；VP1、VP4、VP6 三种蛋白构成复制复合体与基因组共同位于病毒粒子的内部，负责病毒基因组的修饰和复制;4种非结构蛋白在病毒复制、装配、释放以及抗天然免疫应答等过程中扮演重要角色5-6 。目前尚无有效的蓝舌病治疗方案，疫苗免疫接种仍是预防和控制该病的重要手段。国际上使用的BTV疫苗主要为减毒活疫苗和灭活疫苗,减毒活疫苗是最先投人使用的BTV疫苗，在非洲国家早期防控蓝舌病的过程中发挥了不可替代的作用。但由于其自身存在各种安全风险，包括致畸性、毒力返强、免疫抑制和易与田间毒株发生基因重组，目前，大多数国家已不再使用减毒活疫苗7 8 。值得注意
14、的是，我国目前没有任何商品化的可用于预防蓝舌病的疫苗。随着我国国际贸易的扩大和“一带一路”倡议的实施，尤其是2 0 18 年8 月以来非洲猪瘟在我国的大暴发流行和蔓延，进一步警醒我们针对重大动物疫病必须提前做好充足的技术和疫苗储备。本研究首先比较了二乙烯亚胺(BEI)、甲醛和-丙内酯(BPL)3种灭活剂对BTV-1的灭活效果，选用BEI作为灭活剂制备BTV-1灭活疫苗并免疫动物，通过测定抗体效价对该疫苗的免疫效果进行了评价。1材料与方法1.1病毒、细胞及实验动物BTV-1毒株和乳仓鼠肾细胞(BHK-21)均由中国农业科学院兰州兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室保存。18 只3月龄健康小尾寒羊
15、购自甘肃省景泰县某养殖场，其蓝舌病毒抗体检测均为阴性。1.2主要试剂DMEM培养基购自HyClone公司。胎牛血清购自Gibco公司。低熔点琼脂糖购自Sigma公司。BEI购自北京依托华茂生物有限公司。BPL购自美国AMRESCO公司。硫代硫酸钠、甲醛（分析纯)均购自北京化工厂。TRIzolreagent购自Invitrogen公司。辣根过氧化物酶标记的山羊抗家兔IgG抗体购自Ab-cam公司。疫苗佐剂MontanideISA61VG和Mon-tanideISA201VG购自赛比克（SEPPIC）上海公司。家兔抗BTVVP6、VP7、NS1和NS2多克隆抗体均由本实验室制备并保存。BTV竞争E
16、LISA试剂盒由本实验室研制。SuperSignalWestPicoPLUS化学发光底物购自Thermo公司。1.3病毒抗原的制备将BTV-1以MOI=0.1的病毒量接种到单层BHK-21细胞中,37、50 mL/LCO2培养箱培养至90%以上的细胞发生病变时收获细胞，反复冻融3次后离心，用噬斑试验(plaqueassay)测定病毒效价后作为疫苗抗原置于一8 0 保存备用。1.4不同灭活剂对病毒灭活效果的比较.4.1不同灭活剂对病毒的灭活取上述病毒液1133第9 期车永军等：蓝舌病毒1型灭活疫苗的制备与免疫效果15mL（病毒含量1.54510 PFU)分装到3个离心管中，分别加人不同的灭活剂进
17、行灭活。1.4.1.1二乙烯亚胺灭活将经0.2 2 m滤膜过滤除菌的BEI溶液以终体积分数为12 mL/L加人病毒液中，充分振荡混匀。30 灭活处理6、12、2 4、36、48h后分别取样1mL,加入终质量浓度为2 0 g/L的硫代硫酸钠溶液充分混匀，置于4冰箱备用。1.4.1.2甲醛灭活舌将无菌的甲醛溶液以终体积分数为2 mL/L加人病毒液中,充分振荡混匀。37 灭活处理6、12、2 4、36、48 h后分别取样1mL，加人终质量浓度2 g/L的焦亚硫酸钠溶液充分混匀，置于4冰箱备用。1.4.1.3-丙内酯灭活将-丙内酯溶液加人病毒液中使其终体积分数为0.5mL/L，充分振荡混匀。4灭活处理
18、6、12、2 4、36、48 h后分别取样1mL，于37 放置2 h，置于4冰箱备用。1.4.2细胞感染试验以未经灭活的病毒液作为对照，将不同灭活处理后的病毒样品作10 倍系列稀释后，用BHK-21细胞进行噬斑试验，同时将上述样品接种BHK-21细胞，连续盲传3代，每次接毒后定期观察记录细胞病变情况,以确定灭活剂的灭活效果。1.4.3灭活病毒蛋白的免疫印迹检测将上述不同灭活处理的病毒抗原样品离心，收集沉淀经SDS-PAGE后再进行转膜、封闭，然后分别以家兔抗BTVVP6、VP7、NS1和NS2多克隆抗体为一抗，HRP标记的山羊抗家兔IgG为二抗进行孵育，加人SuperSignal WestPi
19、coPLUS化学发光底物显色，用高分辨率图像采集系统观察并采集图像1.5灭活疫苗的制备利用BEI将 1.2 X10PFU的 BTV-1病毒液处理48 h灭活。参照佐剂使用说明书，将灭活病毒分别与Montanide ISA61VG佐剂和Montanide ISA201VG佐剂等体积混合乳化制备疫苗。乳化完成后室温静置1h分装4保存。使用前，观察2 种疫苗的外观状态，并用移液枪分别吸取10 L滴于冷水表面静置10 min,观察其在水中的扩散情况。1.6疫苗接种将18 只BTV抗体阴性小尾寒羊随机分为3组（编号GAG C),每组6 只,免疫前采集血液分离血清。其中,GA组接种ISA201VG佐剂灭活
20、疫苗,GB组接种ISA61VG佐剂灭活疫苗,GC组设为对照,2种佐剂乳化的BHK-21细胞悬液各接种3只。免疫方式为大腿内侧皮下多点注射，免疫剂量均为1107PFU/只，4周后用相同剂量疫苗和途径进行加强免疫。在首次免疫后第1 8、11、15、19、2 4、2 9周采集血液分离血清，分别用竞争ELISA和噬斑减少中和试验(PRNT)检测抗体。1.7抗体效价的竞争ELISA测定利用本实验室研制的竞争ELISA方法测定采集分离的BTV血清抗体，步骤如下：在96 孔ELISA板上以碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液包被纯化的BTVVP7蛋白过夜，脱脂奶粉溶液封闭1h，加人倍比稀释(1：8 1：10 2 4)的阴
21、、阳性对照血清和待检血清后，再加家兔抗BTV竞争抗体，37 培养箱中反应1h，加人10 0 0 0 倍稀释的HRP标记的山羊抗家兔IgG,37反应30 min后加人TMB显色剂避光显色10min,加入终止液终止反应，用酶标仪测定D450m值。竞争ELISA测定的抗体效价的结果判定：竞争抗体对照孔的D450mm值不小于1.0,用对照孔的平均D450mm值除以2 即为50%对照值，50%对照值 待检血清D450mm值的最大稀释倍数即为其BTV抗体效价，当抗体效价大于1：32 时判为BTV抗体阳性。1.8噬斑减少中和试验利用噬斑减少中和试验检测免疫前及免疫后第3、7、11、15周血清样品中中和抗体的
22、效价。BHK-21细胞铺2 4孔板培养至单层，将待检血清于56水浴中灭活30 min后用DMEM培养基2 倍系列稀释,将各稀释度血清1：2 1：6 4或1：16 1：512)与等体积2 0 0 PFU/mL的BTV-1病毒液混合，混匀后于37 作用1h,将血清与病毒的混合液加人2 4孔板中，37 感作1h，弃去液体，加入500L15g/L低熔点琼脂糖，置于37 细胞培养箱中培养2 3d,用10 0 mL/L福尔马林固定3h，除去琼脂糖凝胶，用结晶紫染色，最后用流水冲洗干净，即可进行噬斑计数。同时设立病毒对照和正常细胞对照,以能减少对照组50%噬斑数的血清最高稀释度为该血清的中和抗体效价。2结果
23、2.1病毒培养及毒价测定分别于病毒感染细胞后第12、2 4、48 和7 2 小时收取细胞样品，反复冻融3次后测定病毒效价。结果（见图1)显示，病毒效价在第48 小时达到最高，此后开始下降，因此在感染后第48 小时收取病毒感染的细胞样品。BTV-1病毒接种BHK-21细胞2 4h后，部分细胞形态变圆、出现皱缩、脱落，48 h后超过90%的细胞出现明显的细胞病变(Cytopathogeniceffect,CPE),并发生脱落，部分细胞裂解（见图2)。用噬斑试验测得病毒效价为1.0 3X107PFU/mL。1134第53卷中国兽医科学(/)8176543012244872感染后时间/hHours p
24、ost infection图1BTV-1感染BHK-21细胞后的生长曲线Figure1Growth curve of BTV-1 infected BHK-21 cellsB图2 BTV-1感染后BHK-21细胞产生的病变Figure 2 CPE in BHK-21 cells infected with BTV-1A:正常的BHK-21 细胞;B:BTV-1感染48 h的细胞病变。A:Uninfected BHK-21 cells;B:BHK-21 cells infected with BTV-1 for48h.2.2用细胞传代检测灭活剂的灭活效果收集不同灭活处理的病毒样品，将其接种至BH
25、K-21细胞利用噬斑试验进行检测,结果显示,经BEI、甲醛和BPL分别灭活处理6、12、2 4h的样品接种BHK-21细胞后均出现明显的CPE,经灭活处理36 h的病毒抗原基本未出现CPE，当BEI、BPL和甲醛灭活处理达到48 h时,3组均未出现肉眼可见的CPE。将未出现CPE的细胞样品反复冻融3次后连续盲传3代，每代次细胞均生长良好且未出现CPE,说明BTV-1被完全灭活2.3灭活病毒蛋白的检测用免疫印迹法对不同灭活条件处理后的病毒抗原样品中结构蛋白VP6、V P7 和非结构蛋白NS1、NS2进行了检测。结果显示,经甲醛灭活处理的病毒样品中只检测到VP7蛋白条带，而未检测到另外3种病毒蛋白
26、条带。而在BPL和BEI灭活处理的病毒样品中均可以检测到VP6、VP7、NS1和NS2四种蛋白，表明这2 种灭活剂在灭活病毒过程中对病毒蛋白抗原的影响较小（见图3）。2.4灭活疫苗的制备与动物免疫观察制备的2 种灭活疫苗发现：MontanideISA61VG佐剂灭活疫苗外观呈乳白色，滴于冷水表面后呈球形滴状,没有发生任何扩散；而MontanideISA201VG佐剂灭活疫苗外观呈淡粉色，滴于水中后液滴呈云雾状扩散，表明用这2 种佐剂制备的疫苗均符合实验要求。2.5血清抗体效价的竞争ELISA检测利用竞争ELISA方法对免疫绵羊的血清进行BTV抗体水平检测。结果（见图4)显示，免疫组绵羊血清BT
27、V抗体效价在首次免疫1周后迅速升高，之后逐渐缓慢下降，到第4周时下降至1：16 左右。但经第4周加强免疫后BTV抗体效价再次升高，而且在此后的2 9周内抗体持续保持在较高的水平。两种佐剂疫苗免疫绵羊产生的BTV抗体的效价都较高，同时ISA61VG佐剂免疫组产生的BTV抗体效价整体较ISA201VG佐剂疫苗组稍高而且下降速度也较慢，对照组绵羊BTV抗体效价在整个检测过程中基本无变化2.6中和抗体效价的测定采用噬斑减少中和试验测定免疫绵羊血清中的BTV中和抗体,抗体效价以血清稀释倍数的反对数表示。结果（见图5)显示，首次免疫3周后免疫组绵羊能够产生中和抗体但抗体效价不高，在加强免疫3周后ISA20
28、1VG免疫组和ISA61VG佐剂免疫组绵羊中和抗体效价（1g）可分别达到2.0 5土0.2 0 6和2.10 土0.17 3；2 种佐剂疫苗免疫绵羊后均可产生较高水平的BTV中和抗体，而且ISA61VG佐剂免疫组诱导产生的BTV中和抗体效价整体较ISA201VG佐剂疫苗组高且稳定,整个试验过程中对照组绵羊血清中和抗体效价基本无变化，3讨论1979年在我国云南省首次发现绵羊蓝舌病，之后在湖北、安徽、四川、山西、新疆、甘肃、内蒙古、辽宁、吉林、广东和广西等多个省份的牛羊血清中相继检出了BTV抗体5。到目前为止，在我国已经发现了已知2 9种血清型中的16 种，包括血清型15、7、9、11、12、14
29、、15、16、17、2 1、2 4和2 9,其中威胁我国牛羊产业发展的主要致病血清型为1型和16型9-10 。虽然我国目前尚未发现自2 0 0 6 年以来流行于欧洲的BTV强毒株，但是随着进出口贸易的日益频繁和环境气候的不断变化，国外的BTV强毒株传到国内的风险非常高。此外，我国至今没有任何商品化的蓝舌病疫苗，因此，开展BTV灭活疫苗研究具有重要意义。研究表明,甲醛与病毒液反应时,容易使病毒蛋白发生交联或使病毒颗粒聚集，阻止了灭活剂进一步作用于病毒核酸，可能有病原体未被完全灭活1135车永军等：蓝舌病毒1型灭活疫苗的制备与免疫效果第9 期123456789101112131436kuA1234
30、56789101112131438 kuB123456789101112131464 kuC123456789101112131442kuD图3灭活病毒蛋白的免疫印迹检测Figure 3 Proteins detection of inactivated BTV-1 by Western-blotA:VP6结构蛋白;B:VP7结构蛋白；C:NS1非结构蛋白;D:NS2非结构蛋白。1,9:未灭活病毒样品；2 5:分别为经BPL灭活处理12、2 4、36、48h的病毒样品；6 8,14:分别为经甲醛灭活处理12、2 4、36、48 h的病毒样品;10 13：分别为经BEI灭活处理12、2 4、36
31、、48 h的病毒样品。A:VP6 structural protein;B:VP7 structural protein;C:NS1 nonstructural protein;D:NS2 nonstructural protein.1,9:Uninactivated virus sample;25:Virus samples inactivated by BPL for 12 h,24 h,36 h and 48 h,respectively;68,14:Virus samples inactivated by formaldehyde for 12 h,24 h,36 h,48 h,res
32、pectively;1013:Virus samples inactivated by BEI for 12 h,24 h,36 h,and 48 h,respectively.12一GAISA201GB ISA6110GC Control8工士620012345678910111213141516171819202122232425 26272829免疫后时间/周Weeks post immunization图4免疫绵羊BTV抗体效价的测定Figure 4 Determination of BTV antibody titer of immunized sheep1136第53卷中国兽医科学
33、2.51GA ISA201GB ISA612.0GC Control1.51.00.500371115免疫后时间/周Weeks post immunization图5中和抗体效价的测定Figure5Determination of neutralizing antibody titer而存在疫苗散毒的风险，同时病毒的抗原性遭到破坏从而可能降低疫苗的免疫原性11。本研究中利用免疫印迹检测灭活病毒的VP6、VP7、NS1和NS2四种蛋白，结果发现在甲醛灭活处理后的病毒样品中仅检测到了VP7蛋白，而VP6、NS1和NS2蛋白未被检测到,推测甲醛可能使病毒蛋白的结构发生了改变。此外,甲醛作为灭活剂还存
34、在一些缺陷,如具有刺激性气味、容易致癌且残留甲醛易损伤机体等。BPL灭活病毒的原理是直接作用于病毒核酸通过烷基化作用使病毒核酸的嘌呤和嘧啶构象发生改变，不破坏病毒的蛋白结构及其功能就可达到灭活病毒的目的12 。因此,BPL在灭活过程中对病毒抗原蛋白的影响较小，使其保持了较好的免疫原性。另外,BPL在37 极易水解为机体脂肪代谢产物-羟基丙酸，不会对机体产生副作用。但BPL作为灭活剂的缺点是长时间保存会发生自身聚合进而影响灭活效果，同时成本较高，价格昂贵，不宜用作动物疫苗灭活剂。BEI是一种烷化剂，由于其保存运输比较方便、毒性较小及成本较低而被人们广泛使用。BEI能够破坏病毒核酸,使病毒丧失感染
35、力，而不影响病毒抗原蛋白的空间构象和抗原决定簇，从而使病毒抗原的免疫原性不被破坏，是制备灭活病毒疫苗比较理想的灭活剂13。本研究结果表明,BEI、BPL 和甲醛均能在48 h完全灭活BTV,且在BPL和BEI灭活处理的病毒样品中均可以检测到VP6、V P7、NS1和NS2四种病毒蛋白,表明这2种灭活剂在灭活病毒过程中对病毒蛋白抗原影响较小。综上所述，作为蓝舌病毒1型灭活剂,BEI较BPL更具有优势。本研究用制备的2 种不同佐剂BTV-1灭活疫苗在绵羊上进行了免疫效力评估。对绵羊进行首次免疫后BTV抗体效价迅速升高，之后缓慢下降，因此在首次免疫4周后对所有绵羊进行了加强免疫。经过加强免疫后绵羊B
36、TV抗体效价和中和抗体效价均出现明显升高，首次免疫后第2 9周绵羊BTV抗体效价仍能稳定保持在较高的水平，同时ISA201VG佐剂疫苗和ISA61VG佐剂疫苗加强免疫绵羊3周后BTV中和抗体效价（lg）可分别达到2.050.206和2.10 0.17 3,且与ISA201VG佐剂疫苗相比,ISA61VG佐剂灭活疫苗免疫产生的BTV抗体效价稍高。由此可见，本研究制备的BTV-1型灭活疫苗能够很好地诱发绵羊产生BTV抗体免疫应答，这也为研制其他血清型蓝舌病疫苗奠定了基础。参考文献(References)1WHITE D M,WILSON W C,BLAIR C D,et al.Studies on
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