1、EBEB病毒永生化细胞模型在病毒永生化细胞模型在 人类疾病基因研究中的应用人类疾病基因研究中的应用 朱朱 振振 宇宇 教授教授 博士生导师 中山大学中山大学 中山医学院中山医学院 达安基因股份达安基因股份 EB病毒相关人淋巴母 细胞系的蛋白质表达谱研究 国家自然基金30672358 负责人 1、病人的肿瘤细胞中隐匿着EB病毒 发现发现 EB病毒是病毒是1964年年Epstein与与Barr在非洲儿童恶性淋巴瘤的瘤细胞中观在非洲儿童恶性淋巴瘤的瘤细胞中观察到的一种疱疹病毒。察到的一种疱疹病毒。1966年年Old等采用免疫扩散法发现等采用免疫扩散法发现鼻咽癌病人的血清能与非洲儿童淋巴鼻咽癌病人的血
2、清能与非洲儿童淋巴细胞的抽提液起反响。细胞的抽提液起反响。1、病人的肿瘤细胞中隐匿着EB病毒 证据证据1：1969年年de-the从鼻咽癌活检培养的从鼻咽癌活检培养的类淋巴细胞中别离出类淋巴细胞中别离出EB病毒病毒。国内也已经从鼻咽癌组织培养所建国内也已经从鼻咽癌组织培养所建立的类淋巴母细胞株中证明带有立的类淋巴母细胞株中证明带有EB病病毒壳抗原毒壳抗原VCA和早期抗原和早期抗原EA，并在电镜下找到了典型的疱疹病毒颗并在电镜下找到了典型的疱疹病毒颗粒粒，其形态与其形态与EB病毒相同病毒相同。1、病人的肿瘤细胞中隐匿着EB病毒 证据证据2：Kottaridis SD等等1996年认为鼻年认为鼻咽
3、癌患者血清中抗咽癌患者血清中抗EBNA的水平反映的水平反映肿瘤的大小肿瘤的大小。Anticancer Res,1996,16(2):785-789 Vera-Sempere FJ等等1996年年采用巢式采用巢式PCR和免疫组化分析说明了和免疫组化分析说明了不管组织学类型，鼻咽癌中均有不管组织学类型，鼻咽癌中均有EB病病毒感染。毒感染。Eur J Cancer B Oral Oncol,1996,32B(3):163-168 2、几乎100%鼻咽非角化性癌均有EBV感染。在我国，几乎所有四岁以上的人群均已感染过EBV，80%以上的健康成人是EBV携带者。特别在珠江三角洲及香港地区，是世界上NPC
4、的高发区。根据中山市的肿瘤统计资料流行病学，NPC的年龄和性别的校正发病率为18.12/10万(男：25.60/10万；女：11.05/10万)。97%的NPC为非角化性癌。经EBER1原位杂交所谓“金标准 证实癌细胞中有EBV感染。一、鼻咽癌与EB病毒感染的关系 小结：流行病学小结：流行病学、血清学和分子生物血清学和分子生物学的资料证实学的资料证实,EBV感染与感染与NPC有密有密切关系切关系。鼻咽癌患者癌细胞中证实有鼻咽癌患者癌细胞中证实有EB病病毒的毒的DNA，经原位杂交经原位杂交，多数癌细胞多数癌细胞呈呈EBERs阳性阳性、核抗原核抗原EBNA-1阳性阳性。鼻咽癌患者肿瘤细胞中有鼻咽癌
5、患者肿瘤细胞中有EB病毒病毒，血清有一套抗血清有一套抗EB病毒的抗体病毒的抗体，血清中血清中的的EBV抗体水平普遍升高抗体水平普遍升高。1997年世界卫生组织在国际抗癌年世界卫生组织在国际抗癌联盟年会上把联盟年会上把EBV归类为第一类致癌归类为第一类致癌物物特别是鼻咽癌特别是鼻咽癌。二、EB病毒携带者与鼻咽癌病人血清中EBV抗体的不同 EBV血清学诊断利用血清学诊断利用NPC的一个特征，的一个特征，即患者多种即患者多种EBV抗体的水平较非患者高抗体的水平较非患者高Werner Henle et al.,1976.。EBV血清学诊断已用于血清学诊断已用于NPC高危人群高危人群的筛查和对的筛查和对
6、NPC可疑病例的诊断。根据可疑病例的诊断。根据从从70年代后期以来的研究结果，年代后期以来的研究结果，VCA-IgA检测通常被用于筛查以排除检测通常被用于筛查以排除NPC的诊的诊断断；EA-IgA检测目前被用于检测目前被用于NPC确实定确实定性检测。性检测。二、EB病毒携带者与鼻咽癌病人血清中EBV抗体的不同 检测哪种抗体？检测抗体哪种类型？因为鼻咽癌NPC是来源于鼻咽粘膜上皮细胞的低分化或未分化癌。所以我们可以先了解EB病毒在上皮细胞中的潜伏感染以及两种形式的EB病毒感染所表达的各种抗原。各种抗原相应产生不同的特异性抗体中哪种有代表性？1、EB病毒的潜伏感染 上皮细胞中病毒复制循环中的B淋巴
7、细胞池 长期潜伏感染 如果感染了无复制缺陷突变的病毒 EB病毒感染口咽上皮细胞 如果感染了复制缺陷突变的病毒 待上皮细胞增生后个别细胞死亡EB病毒 引自:J Immmunol.2022;17498:4972-8 2、两种形式的、两种形式的EB病毒感染病毒感染 潜伏性感染潜伏性感染(latent infection)I型潜伏性感染型潜伏性感染:表达表达EBNA1，病征为病征为 Burkitt 淋巴瘤淋巴瘤 II型潜伏性感染型潜伏性感染:表达表达EBNA1和和LMP1、LMP2A、LMP2B，病征为病征为Hodgkin 淋 巴 瘤淋 巴 瘤、鼻 咽 癌鼻 咽 癌、鼻 型鼻 型 NK/T-细胞淋巴瘤
8、细胞淋巴瘤、T-细胞淋巴瘤细胞淋巴瘤 III型潜伏性感染型潜伏性感染:表达表达EBNA1、EBNA2、EBNA3、EBNA4、EBNA5、EBNA6，病征为传染性单病征为传染性单核细胞增多症核细胞增多症、移植后淋巴移植后淋巴 组织增生性疾病组织增生性疾病 溶解性感染溶解性感染(lytic infection)在在EBV潜伏感染的淋巴细胞中有小局部潜伏感染的淋巴细胞中有小局部约约15%20%出现溶解性感染出现溶解性感染，溶解性溶解性感染出现三个时相感染出现三个时相phase。立即早期立即早期:表达表达Zta(ZEBRA)、EBNA1等等 早期早期:表达表达EA(D)、EA(R)、EBNA1等等
9、晚期晚期:表达表达VCA、EBNA1等等 EBNA-1 是在所有不同是在所有不同EBV感染细胞中都出感染细胞中都出现的唯一抗原现的唯一抗原。EBNA 1 IgA 的抗体水平 在NPC患者中高于正常的EBV携带者 EBNA1-IgA检测的检测的OD值范围分布图值范围分布图05101520253035-(0.8-0.7)-(0.6-0.5)-(0.4-0.3)-(0.2-0.1)0-0.10.2-0.30.4-0.50.6-0.70.8-0.9OD Range%Normal%NPCCutoff OD 小结 NPC主要表现是主要表现是EBV潜伏感染伴少量溶解性感潜伏感染伴少量溶解性感染染。EBNA-
10、1 是在所有不同是在所有不同EBV感染细胞中都出感染细胞中都出现的唯一抗原现的唯一抗原。NPC是来源于鼻咽粘膜上皮细胞是来源于鼻咽粘膜上皮细胞，检测上皮细检测上皮细胞的分泌型胞的分泌型IgA抗体水平对抗体水平对NPC较有诊断意义较有诊断意义。NPC的显著特征是病人血清中的的显著特征是病人血清中的EBV抗体抗体尤尤其是其是IgA亚型亚型水平普遍升高水平普遍升高，这种变化在这种变化在NPC发病前期将先于病症出现发病前期将先于病症出现，借此可区分借此可区分NPC与其与其它它EB病毒感染相关疾病或健康携带者病毒感染相关疾病或健康携带者。我们认为我们认为EBNA1/IgA抗体水平的检测对抗体水平的检测对
11、NPC高高危人群的筛查可作为早期发现鼻咽癌的有效手段危人群的筛查可作为早期发现鼻咽癌的有效手段之一之一。EB病毒在人类普遍易感病毒在人类普遍易感,多种疾病相关，多种疾病相关，如传染性单核细胞增多症、如传染性单核细胞增多症、Birkitt，s淋巴淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤等瘤、非何杰金淋巴瘤等 体外只能感染人体外只能感染人B B淋巴细胞淋巴细胞 其致病机制仍不清楚，原因可能与其致病机制仍不清楚，原因可能与病毒在体外对大多数细胞都不易感病毒在体外对大多数细胞都不易感染有关染有关 上皮细胞内可以表现为裂解感染，上皮细胞内可以表现为裂解感染，在淋巴细胞内主要表现为潜伏感染在淋巴细胞内主要表现为潜伏感染 E
12、B病毒是病毒是DNA病毒，其基因组是线性病毒，其基因组是线性双链双链DNA，长，长172Kb，由末端直接重复，由末端直接重复序列序列terminal direct repeats TR、内部直接重复序列内部直接重复序列(internal direct repeats IR)、DL、DR和重复序列之间和重复序列之间的单一序列构成的单一序列构成 研究现状研究现状 目前对病毒的致病机制的了解均来源目前对病毒的致病机制的了解均来源于于EB病毒病毒在体外感染在体外感染B B淋巴细胞而建淋巴细胞而建立的立的淋巴母细胞系淋巴母细胞系 其致病基因主要有细胞源性基因和病其致病基因主要有细胞源性基因和病毒的潜伏感
13、染基因毒的潜伏感染基因 EB病毒在病毒在B细胞内以潜伏感染方式存在，细胞内以潜伏感染方式存在，此时，病毒基因组中只有约此时，病毒基因组中只有约9种基因表达，种基因表达，编码病毒核抗原编码病毒核抗原6种以及潜伏膜蛋白种以及潜伏膜蛋白3种和一些非信使种和一些非信使RNA 9种病毒蛋白对于病毒转化细胞种病毒蛋白对于病毒转化细胞起到必需或重要作用起到必需或重要作用 不同病理组织来源的不同病理组织来源的EB病毒阳性病毒阳性细胞中病毒的基因表达谱有差异三细胞中病毒的基因表达谱有差异三种假说解释种假说解释 1、“hit-and-run：癌变早期有较多基：癌变早期有较多基因表达，在最终的肿瘤组织中某些基因因表
14、达，在最终的肿瘤组织中某些基因的表达被下调或消失的表达被下调或消失 2、细胞遗传学异常取代了病毒转化基因、细胞遗传学异常取代了病毒转化基因的表达，如在的表达，如在Burkitts淋巴瘤中染色体移淋巴瘤中染色体移位使得位使得c-myc的表达下调的表达下调 3、除、除B细胞以外其他类型的细胞转化或细胞以外其他类型的细胞转化或许需要不同的病毒基因表达谱许需要不同的病毒基因表达谱 对人类基因或基因组的研究是说明疾病病因、发病机理，建立新型诊断方法，并找寻有效的个体化治疗途径的重要环节 发现鉴定某些疾病相关基因的经典路线是：提取细胞/组织的DNA或RNA，PCR/RT-PCR后电泳，对特异性条带测序。对
15、于某些家族多发性疾病而言这条路线的工作量之大是不言而喻的，因此标本的预处理和保存就是一个不可回避的重要课题 超低温冰箱和液氮都不能很好的长期保存标本 细胞永生化是一种使细胞获得无限传代能力的技术 通过对细胞的适当处理使其在保存原来细胞某些特性的前提下无限增殖。由于可以用于长期稳定的保存疾病相关信息，便于多年后开展回忆性比照研究，从而更有利于对疾病的病因、发病机制的说明，目前该技术已广泛应用于诸如白血病、鼻咽癌、肉瘤以及登革热等多种临床疾病的研究 本实验室长期从事EB病毒致B淋巴细胞永生化的研究，已经成功建立了病毒相关人外周血淋巴细胞永生化细胞模型并开展了相关研究。本工程旨在通过建立稳定的携带疾
16、病相关信息的永生化细胞系而使珍贵标本得以长期保存，从而为疾病相关基因的发现和鉴定提供得力保障 细胞永生化技术路线：培养B95.8B95.8细胞 收集EBEB病毒 别离外周血 淋巴细胞 病毒液和淋巴细胞共培养2 2小时 离心收集细胞 RPMI1640RPMI1640培养约2 2月 100bp 200bp 300bp 400bp 500bp 600bp 2000bp LCLsLCLs的的LMP1LMP1基因基因mRNAmRNA水平的检测水平的检测,扩增片断长度为扩增片断长度为424424bp.LCL1bp.LCL1-5 5、LCL2LCL2-5 5、LCL3LCL3-5 5、LCL4LCL4-3030、LCL5LCL5-3030都有都有 LMP1LMP1基因基因mRNAmRNA水水平的表达平的表达 LCLsCD19，CD20抗体的表达抗体的表达 正常外周血淋巴细胞正常外周血淋巴细胞 CD19CD19阳性率为阳性率为9.6%9.6%LCLsCD19，CD20抗体的表达抗体的表达 LCL1LCL1-5 5 CD19CD19阳性率为阳性率为97.1%97.1%LCLsCD19，CD20抗体的表达
