1、复旦大学附属华山医院抗生素研究所 叶信予 deb_ 药敏试验质量控制的目的 保证细菌的鉴定和药敏结果在临床诊断和治疗中的准确性和可靠性 满足疾病诊断和治疗的要求，实事求是地反映检验标本的客观存在 与国际资料具有可比性 室间质控（external quality control）是由外部机构控制实验室质量的客观过程。内容：病原菌鉴定、药物敏感试验 目的：比较差异、改进措施、确定培训需求、客观 证据、支持实验室认可、增加实验室信心、监督工具 国内外权威机构：国内：卫生部临床检验中心、上海临床检验中心 等 国际：WHO/CDC 抗菌药物敏感性试验质控 英国 环球微生物学质控 美国 CAP质控 室内质
2、控（internal quality control)保证检验质量的高水平 实验室工作人员的素质 微生物检验的标准操作（细菌鉴定、药敏试验）标本取材、登记、采集 检测仪器的性能 培养基、试剂质量、保质期 标准菌株 药物敏感性试验 测定抗菌药物在体外对病原微生物有无抑制作用的方法 世界卫生组织推荐：常规的药敏方法为纸片琼脂扩散法（K-B纸片琼脂扩散法）科研方面主要为稀释法，包括液体稀释法（试管法、微量法）和琼脂稀释法 分子生物学方法、酶试验 K-B纸片琼脂扩散法 是一种定性试验：S、I、R 操作简便，常规工作中最常应用 影响因素多 存在一定局限性 稀释法 肉汤稀释法 常量（大量）肉汤稀释法（试管
3、法）微量肉汤稀释法 琼脂稀释法 是一种定量方法，结果精确 操作繁琐，要求严格 E-test法 定量方法 操作简便，容易观察 价格昂贵 分子生物学法 测遗传耐药机制 如PCR检测葡萄球菌mecA基因等 其他还有核酸杂交等方法 酶试验 测生化耐药机制。如碘量法、酸量法、Nitrocefin法等测-内酰胺酶。ESBLs、AmpC酶检测等。-内酰胺酶试验阳性：可快速预报嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、卡他莫拉氏菌对青霉素、氨苄青和羟氨苄青霉素耐药。葡萄球菌对青霉素及氨基、羧基和酰脲基青霉素类药物的耐药性。纸片琼脂扩散法 如果仅仅基于抑菌环的有无，而不考虑抑菌环的大小，则无法检测抗菌药物的敏感性。只有将检测方法和
4、抑菌环直径测量标准化的方法相结合进行试验，才能获得可信的结果。必须采用CLSI推荐的标准操作方法进行试验，才能获得可重复的结果。纸片琼脂扩散法的影响因素 技术人员的操作 培养基 药敏纸片 接种物制备 试验操作 孵育条件、温度和时间 药敏结果读取 质控菌株 技术人员 应经过训练 能进行检验 能熟练使用仪器 有评价检验结果有效性的能力 细心、用心、责任心 培养基 水解酪蛋白琼脂（M-H琼脂）：最适用于常规药敏测试非苛养菌的培养基。原因：药敏试验显示了可接受的批间重复性。其含有影响磺胺、甲氧苄啶和四环素敏感性试验结果的抑制剂浓度低。能使绝大多数非苛养菌生长良好。已积累了用此培养基进行的敏感性测试的大
5、量数据和经验。培养基 苛养菌：需加入营养添加剂 5%脱纤维羊血MH琼脂 含SR158生长因子的HTM培养基 GC琼脂基质+1%规定的生长添加剂 培养基 pH值：室温条件下7.2-7.4之间。因此必须在凝固之后检测 检测方法：浸渍足够多的琼脂完全掩盖pH机电极的尖端 少量的琼脂在烧杯中凝固在pH机电极的尖端的周围 使用表面电极 培养基 pH值小于7.2，变化会显著改变一些药物的抑菌环大小 氨基糖苷类、克林霉素、大环内酯类及喹诺酮类抑菌环变小 青霉素、四环素抑菌环变大 pH值大于7.4，会出现相反的结果 培养基 胸苷或胸腺嘧啶：过量可以逆转磺胺类和甲氧苄啶的抑制作用，从而产生更小、更不清楚的抑菌环
6、，甚至没有抑菌环的出现，可能导致错误的耐药报告 粪肠球菌ATCC 29212，用复方新诺明纸片测试，满意结果为清晰、鲜明的抑菌环，直径20mm 培养基 二价阳离子：钙和镁离子：影响氨基糖苷类和四环素对铜绿假单胞菌的药敏结果。含量过高，抑菌环变小 含量过低，抑菌环变大 钙离子含量的变化也会影响达托霉素的药敏结果 含量过低，抑菌环变小 含量过高，抑菌环变大 过量的锌离子可使碳青霉烯类抑菌环变小 培养基 平板厚度一定要标准，达到4mm厚度 9cm平板倾注琼脂量25-30ml；15cm平板需60ml左右 同一平板内的琼脂要均一厚度 湿度：使用时，琼脂的表面应是潮湿的，但不能有液滴出现在培养基的表面或平
7、板盖子上 有效期：7天 储存温度：2-8 药敏纸片 可靠的供应商：OXOID、BD 纸片应当同时至少有一个分析说明的纸片批号和浓度的证书，并能提供用推荐的质控细菌进行质控的数据 药物含量必须符合CLSI规定的浓度 药敏纸片 纸片的储存：药敏纸片的外包装可以确保适当的无水条件 纸片应冷冻在-20或以下的冰箱内，密封保存。除了因工作需要而少量冷藏外（最多冷藏一个星期），尤其是含-内酰胺类药物、不稳定药物（如亚胺培南、头孢克洛、克拉维酸复合剂）一旦药敏纸片从密封的包装中取出，必须放置在一个完全密封干燥的容器中储存 药敏纸片 药敏纸片的使用 使用前从冰箱内取出并除去密封包装，平衡至室温。这样可以最大限
8、度地减少热空气接触冷的纸片时产生冷凝水 只使用没有超过制造商表明的有效期的纸片，丢弃过期的纸片 药敏纸片 接种物制备 浊度标准：0.5麦氏浓度标准，相当(1-2)108个菌落形成单位(CFU)/ml。接种物浓度过高，会导致某些-内酰胺类药物耐药 校准方法 肉眼观察比浊：应在足够的光线下贴靠着有白色背景和对比黑线的比色卡比较接种管和0.5麦氏浓度标准管 BaSO4浊度标准管：625nm处的吸光度值为0.08-0.10，每次使用需要充分震荡，每个月更换 商品化的乳胶悬浮液：每次使用之前上下颠倒混匀，有效期内使用 光学浊度仪 接种物制备 细菌生长曲线 迟缓期：菌体增大，代谢活跃，为细菌的分裂增值合成
9、、储备足够的酶、能量及中间代谢产物，1-4h 对数期：此期细菌形态、染色、生物活性都很典型，对外界环境因素的作用敏感，抗菌素作用对该时期的细菌效果最佳,8-18h 稳定期：此期细菌形态、染色、生物活性可出现改变，并产生相应的代谢产物 衰亡期：生理代谢活动趋于停滞 接种物制备 制备方法 直接菌落悬浮法：最方便的方法。可用于大多数细菌。从16-18h培养的琼脂平板（应选用非选择性培养基，如血平板）上挑取数个单个菌落 直接接种到肉汤或生理盐水制成菌悬液，调整菌悬液至0.5麦氏。接种物制备 制备方法 生长法：无法用上述方法制备菌悬液的情况下选用。从琼脂平板上选择3-5个形态相同的单个菌落，用接种环或无
10、菌拭子将菌落转移至含有4-5ml合适的肉汤培养基的试管中，如胰蛋白酶大豆肉汤。在35孵育培养，直到达到或超过0.5麦氏浓度（通常2-6h）浊度。用无菌生理盐水或肉汤调整新鲜生长的肉汤悬液的浊度到0.5麦氏浓度。试验操作 接种平板：调整好浊度的菌悬液最好在15min内将无菌棉签浸取，同时在管壁上出去棉签上多余的液体 用拭子划线整个琼脂表面，接种于表面干燥的MHA平板上，每次旋转平板约60，以确保每次接种均匀分布，最后在琼脂平板的边缘涂抹一圈 盖子可半开3-5min，但不可超过15min，以便放置药敏纸片前，使琼脂吸收表面多余的水分 试验操作 放置纸片：将预先设定好并已经平衡至温度的药敏纸片分置在
11、已接种细菌的琼脂表面 每个纸片必须压下以确保与琼脂表面完全接触。无论是单独放置或使用纸片分配设备，纸片必须分布均匀，两纸片圆心的距离不少于24mm 最好在预期的产生小的抑菌环的纸片旁边放置产生大的抑菌环的纸片，以避免重叠区 纸片距离琼脂边缘的距离同样重要，如果太靠近边缘，抑菌环可能不完整，建议距离平板边缘15mm。药敏纸片一旦与琼脂表面接触，就不可再移动 放置纸片后15min内倒置平板进行培养 试验操作 孵育温度：（35 2）孵育条件：除嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌和链球菌外，孵育不需要CO2 CO2浓度变化会显著改变一些药物的抑菌环大小 孵育时间：16-18h 测试 苯唑西林或万古霉素
12、对葡萄球菌属，或万古霉素对肠球菌属的敏感性，孵育时间必须达到24h 细菌 接种物准备方法 接种培养基 纸片数量 培养温度()5%CO2 培养时间（小时）100mm 150mm 一般需氧菌 直接菌落悬浮法，生长法 MHA 5 12 352 不需要 16-18 肺炎链球菌和其他链球菌 直接菌落悬浮法 5%羊血MHA 4 9 352，不超过37 需要 20-24 流感嗜血杆菌和副流感嗜血杆菌 直接菌落悬浮法 含SR158因子的HTM 4 9 352 需要 16-18 脑膜炎奈瑟菌 直接菌落悬浮法 5%羊血MHA 2 5 352，不超过37 需要 20-24 淋病奈瑟菌 直接菌落悬浮法 GC琼脂基质+
13、1%规定的生长添加物 4 9 361，不超过37 需要 16-18 平板结果判读 培养后的平板观察 细菌的涂布是否满意 接种是否正确 产生的抑菌环是否均匀为圆形 菌苔是否融合生长 如果可见单个菌落，说明接种量过稀，必须重复试验 平板结果判读 测量方法：用肉眼判读，测量完全抑制区的直径，包括纸片的直径 采用游标卡或尺子在培养基的背面测量 将培养基放在一个黑色不反光的背景上，并用反射光观察 如使用血平板，应除去盖子并用反射光照射，在琼脂的上方测量抑菌环 抑菌圈直径阅读游标卡尺 抑菌圈直径阅读直尺 平板结果判读 测量直径 没有肉眼可见的明显的生长区即可认为抑菌圈边缘。只能在放大镜下观察到的细小菌落忽
14、略不计。在一个明显抑菌环内有分散的菌落生长时，应该从原始菌落移种后重新测试。如分散的菌落依然在抑菌环内生长，则应测量无菌落的抑菌环内径。变形杆菌属细菌可迁徙生长到某种抗菌药物抑菌环内，忽略明显的抑菌环内薄纱样迁徙生长。测量血平板上的抑菌环时，测量的是生长抑菌圈，而不是溶血抑制圈。测量含甲氧苄啶和磺胺类药物的抑菌圈时，忽略少量生长，测量比较明显的边缘，以确定抑菌环的直径。细菌 药敏纸片 孵育时间 观察结果 金黄色葡萄球菌 苯唑西林和万古霉素 24h 用透射光（平板举向光源）来检查明显抑菌环内有无耐药菌落的少量生长，抑菌环内任何区域出现可辨别的生长都判为苯唑西林或万古霉素耐药 头孢西丁 16-18
15、h 读取时使用反射光 葡萄球菌属 利奈唑胺 16-18h 读取直径是用透射光，抑菌环内任何区域出现可辨别的生长都判为耐药 肠球菌属 万古霉素 24h 用透射光仔细检查抑菌环内是否有菌落生长，出现任何菌落意味着耐药 结果解释 根据CLSI推荐的判断标准，报告细菌对抗菌药物的敏感性 有判断标准：敏感、中介、耐药 只有敏感的折点：敏感 同属细菌不同种判断标准可能不同 不可能出现的药敏现象 金葡菌：青霉素 S,苯唑西林 R，万古霉素 R 肠杆菌科细菌：第三代头孢菌素 R，第一、第二代头孢菌素 S 嗜麦芽窄食单胞菌：出现碳青霉烯类 S 药敏质控 目的 药敏试验过程的精密度（可重复性）和准确度 在试验中所
16、作用的试剂的性能。进行实验和结果判定操作者的工作情况。责任 制造商：确保制造出合适的产品 实验室：确保试验很好地维护和执行 方法 标准菌株 质控标准菌株 使用精心挑选的质控标准菌株 实验在可接受的标准内操作进行 检测结果可靠 每个质控菌应从认可的来源处获得（美国标准菌库，ATCC）适用于抗菌药物和标准方法（CLSI推荐）质控标准菌株 分类：日常检测质控菌株：确保检测系统正常运行，并且检测结果在制定的范围内 大肠埃希菌 ATCC 25922 金黄色葡萄球菌 ATCC 25923等 补充的质控菌株：用于评价某一特定情况下实验或者检测系统的特性，或称为备用质控菌株 嗜血杆菌 ATCC 10211 肺炎克雷伯菌 ATCC BAA-1705等 质控标准菌株 检测和储存 使用和检测临床分离株相同的材料和方法，按照标准纸片琼脂扩散法，来检测质控菌株 合理储存和维护，确保质控菌具有可接受的性能 储存菌株：长期贮存，可用Microbank,40%甘油肉汤、脱纤维羊血或脱脂牛奶，于-70 低温度保存。半储存菌株：使用中的质控菌应贮存在胰大豆琼脂（非苛养菌）或营养丰富的巧克力琼脂斜面（苛养菌），4-8 保存
