1、1ICS 11.220 B 41 DB37 山东省地方标准 DB37/T 27602016 鸭甲肝病毒血清 1 型和 3 型双重 RT-PCR 鉴别方法 Duplex RT-PCR detection method for duck hepatitis A virus type 1 and 3 2016-05-13 发布 2016-06-13 实施山东省质量技术监督局 发 布 山东省地方标准公开山东省地方标准公开DB37/T 27602016 I 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出。本标准由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。本标准由山东农
2、业大学负责起草，山东省农科院家禽研究所、山东省畜牧兽医职业学院等参加起草。本标准主要起草人：姜世金、谢之景、宋敏训、刁有祥、李舫、张瑞华、陈君豪、陈琳琳、沈美艳。山东省地方标准公开山东省地方标准公开DB37/T 27602016 1 鸭甲肝病毒血清 1 型和 3 型双重 RT-PCR 鉴别方法 1 范围 本标准规定了兽医实验室对两种血清型的鸭甲肝病毒（DHAV）即1型鸭甲肝病毒（DHAV-1）和3型鸭甲肝病毒（DHAV-3）进行双重RT-PCR鉴别的操作规程和技术要求。本标准适用于鸭甲肝病毒血清1型和3型的快速鉴别诊断。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用
3、文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY/T 5542002 鸭病毒性肝炎诊断技术 SN/T 34642012 鸭病毒性肝炎型检疫技术规范 3 实验室条件 3.1 仪器 PCR仪、台式低温高速离心机、电泳仪、电泳槽、冰箱、紫外凝胶成像仪、微量移液器和水浴锅等。3.2 操作区域 样品操作区要有相应的生物安全设施；RNA提取区和RT-PCR配液区要求高度洁净。样品操作区、RNA提取区、PCR扩增区、电泳区应单一方向，不得倒流。电泳区与其他操作区域相互隔离。3.3 操作者 操作者应接受过实验室生物安全培训、分子生物学实验室检测技术培
4、训。4 试剂的准备 4.1 试剂 4.1.1 RNA 提取试剂盒。4.1.2 一步法 RT-PCR 试剂盒。4.1.3 1%琼脂糖凝胶，见 A.1。4.1.4 1TAE 缓冲液，见 A.2。4.1.5 溴化乙锭（10 g/L），见 A.3。4.1.6 核酸电泳加样缓冲液，A.4。4.1.7 DEPC 水，见 A.5。山东省地方标准公开山东省地方标准公开DB37/T 27602016 2 4.1.8 DNA 分子量标准参照物，要求在 100 bp1000 bp 之间有 5 条以上的指示条带。4.1.9 用已知的含有与 RT-PCR 检测引物（附录 B）相对应的且灭活的 1 型鸭甲肝病毒和 3 型
5、鸭甲肝病毒制作的阳性对照标准品。4.1.10 用高压灭菌的蒸馏水作为阴性对照标准品。4.2 引物 序列见附录B，浓度均为10 mol/L。5 操作程序 5.1 样品的采集和处理 对临床发病怀疑感染鸭病毒性肝炎的病例无菌采集鸭肝脏样品，于-20 保存。5.2 设置对照 每次检测时，使用阳性对照标准品和阴性样品对照品，至少设置一个或一个以上的阳性对照和阴性对照。5.3 RNA 提取 参照RNA提取试剂盒的说明书，提取样品和对照的RNA。提取的RNA应随即进行检测，否则应于-70 冻存。5.4 RNA 扩增体系的配制 按照一步法RT-PCR试剂盒说明书要求，配制RT-PCR反应体系。总反应体系为50
6、 L，其中DEPC水12.6 L，2RT-PCR缓冲液25 L，RT-PCR酶混合物2 L，引物DHAV-1F和DHAV-1R（10 mol/L）各1.2 L，引物DHAV-3F和DHAV-3R（10 mol/L）各1.0 L，待检样品RNA 6 L。如果同时进行多个样品的检测，可以按照上述比例，将待检的RNA以外的溶液混合在一起，然后每个RT-PCR管中分别加入44 L此混合液，再加入6 L对应样品的RNA。5.5 RT-PCR 反应 按照一步法RT-PCR试剂盒操作说明，设置反应条件。第一步是RT，AMV反转录酶最适反应温度是42，M-MLV反转录酶最适反应温度是37，反转录时间是30 m
7、in；第二步是灭活反转录酶，95、3 min；第三步是PCR，PCR反应条件为：95 5 min；95 50s，60 50 s，72 40 s，30个循环；72 10 min。5.6 RT-PCR 产物电泳 RT-PCR结束后，每个RT-PCR管加入5 L核酸电泳加样缓冲液，密闭RT-PCR管，成分混合，然后每管取5 L10 L加入1%琼脂糖凝胶板的加样孔中，在位于凝胶中央的加样孔中加入DNA分子量标准参照物。加样后，按照每厘米凝胶5 V电压，电泳20 min40 min。电泳后，置于紫外凝胶成像仪下观察，根据DNA分子量标准参照物判断RT-PCR扩增产物的大小。6 结果判定 山东省地方标准公
8、开山东省地方标准公开DB37/T 27602016 3 阳性对照出现相应大小的目的扩增条带，且阴性对照无此扩增条带时，判定检测有效；否则判定检测结果无效，不能进行判断。按照如下条件进行判定：从样品中只扩增出了 492 bp 的产物，则该样品为 DHAV-1 阳性，DHAV-3 阴性。从样品中只扩增出了 286 bp 的产物，则该样品为 DHAV-3 阳性，DHAV-1 阴性。从样品中同时扩增出了 286 bp 和 492 bp 的产物，则该样品为 DHAV-1 和 DHAV-3 亚型共存在，二者均为阳性。从样品中未扩增出 286 bp 和 492 bp 的产物，则该样品不含有 DHAV-1 和
9、 DHAV-3，二者均为阴性。山东省地方标准公开山东省地方标准公开DB37/T 27602016 4 A A 附 录 A（规范性附录）相关试剂的配制 A.1 1%琼脂糖凝胶 琼脂糖 1.0 g 1TAE电泳缓冲液 加至100 mL 微波炉中完全融化，待冷至50 60 时，加入溴化乙锭（EB）溶液5 L，摇匀，倒入电泳板上，凝固后取下梳子，备用。A.2 1TAE电泳缓冲液 A.2.1 配制0.5 mol/L乙二胺四乙酸二钠（EDTA）溶液（pH8.0）EDTA 18.61 g 灭菌双蒸水 80 mL 氢氧化钠 调pH至8.0 灭菌双蒸水 加至100 mL A.2.2 配制50TAE电泳缓冲液 羟
10、基甲基氨基甲烷（Tris）242 g 冰乙酸 57.1 mL 0.5 mol/L EDTA溶液（pH8.0）100 mL 灭菌双蒸水 加至1000 mL 用时用灭菌双蒸水稀释50倍使用。A.2.3 配制1TAE电泳缓冲液 50TAE电泳缓冲液 20 mL 灭菌双蒸水 加至1000 mL A.3 溴化乙锭（EB）溶液 溴化乙锭 20 mg 灭菌双蒸水 加至20 mL A.4 10加样缓冲液 聚蔗糖 25 g 灭菌双蒸水 100 mL 溴酚蓝 0.1 g 山东省地方标准公开山东省地方标准公开DB37/T 27602016 5 二甲苯青 0.1 g A.5 DEPC（焦碳酸二乙酯）水配制 DEPC
11、1 mL 双蒸水 加至1000 mL 山东省地方标准公开山东省地方标准公开DB37/T 27602016 6 B B 附 录 B（规范性附录）检测引物 检测引物名称、序列、扩增产物大小、适用性等见表B.1。表B.1 检测引物 引物名称 引物序列（53）产物大小（bp）适用性 DHAV-1F CAA CTC GAC CAA THC CTG G 492 DHAV-1 通用 DHAV-1R CCT GRT GRA CCA TTG TRA CTG DHAV-3F GAA ATC TGC ACT CAA TGG AGA G 286 DHAV-3 通用 DHAV-3R CCC AGG AAA TGA TTG GTC AG 注：序列中含有的简并碱基：R=A/G，H=T/C/A。山东省地方标准公开山东省地方标准公开DB37/T 27602016 7 C C 附 录 C（规范性附录）RT-PCR 产物大小对照 PCR产物大小对照见图C.1。图C.1 RT-PCR 产物大小对照 说明：M DNA分子量标准参照物；1DHAV-1和DHAV-3均为阳性；2DHAV-1为阳性，DHAV-3为阴性；3DHAV-1和DHAV-3均为阳性；4DHAV-1和DHAV-3均为阴性。_ 山东省地方标准公开山东省地方标准公开
