1、 ICS 65.020.30 B41 备案号：41148-2014 DB32 江苏省地方标准 DB 32/T 24472013 马立克氏病病毒感染的间接免疫荧光诊断技术操作规程 Diagnostic Techniques of IFA for Mareks Disease 2013-12-30 发布 2014-01-20 实施江苏省质量技术监督局 发 布 DB 32/T 24472013 I 前 言 本标准按GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写的要求编制而成。本标准由扬州大学提出。本标准由扬州大学兽医学院起草。本标准主要起草人：金文杰、秦爱建、崔治中、殷俊、张鑫
2、宇、刘岳龙、邵红霞。DB 32/T 24472013 1 马立克氏病病毒感染的间接免疫荧光诊断技术操作规程 1 范围 本标准规定了马立克氏病病毒感染的间接免疫荧光诊断技术中被检家禽外周血液单核细胞（PBMCs）的制备、用特异性抗体做间接免疫荧光检测待检PBMCs感染的病毒。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 被检家禽外周血液单核细胞（PBMCs）的制备 3.1 待检样品的采集 按照抗凝剂与血液1:9，新
3、鲜采集18日龄以上待检家禽的抗凝血，抗凝剂配制见附录A。3.2 外周血液单核细胞（PBMCs）的制备 将抗凝血缓缓加入装有市售的淋巴细胞分层液的试管中，使血液重叠于分层液上，用水平转子离心机2000转每分钟离心30分钟。用毛细管吸取PBMCs层，置离心管中，用PBS（pH7.2、0.01mol/L，下同，配制见附录B）以1000转每分钟离心10分钟洗涤1-2次，用PBS配成细胞悬液（约107个/毫升）。4 用特异性抗体做间接免疫荧光检测待检 PBMCs 感染的病毒 4.1 抗 MDV 特异性抗体 作为第一抗体，采用抗MDV gB单克隆抗体BA4和BD8（扬州大学江苏省动物预防医学重点实验室制备
4、保存）。4.2 FITC 标记抗体 由于第一抗体为MDV特异性单克隆抗体，所以选用市售的FITC标记的抗小鼠IgG山羊血清作为第二抗体。4.3 悬浮法间接免疫荧光操作过程 a)在 1.5 毫升离心管中加入 100 微升单细胞悬液，再加入 100 微升第一抗体，混匀，37作用45 分钟；b)将细胞重新悬浮于 1 毫升 PBS 中，以 1000 转每分钟离心 5 分钟洗涤，重复一次；c)以 100 微升 PBS 重新悬浮，加 100 微升 FITC 标记羊抗鼠 IgG 抗体，置 37作用 45 分钟；DB 32/T 24472013 2 d)将细胞重新悬浮于 1 毫升 PBS 中，以 1000 转
5、每分钟离心 5 分钟洗涤，重复一次，最后一次离心去上清备用；e)将细胞重新悬浮于 20-30 微升含 10%甘油的 PBS 中，滴加于载玻片上，加盖玻片封片，立即用倒置荧光显微镜观察。4.4 结果的判定 被感染的PBMCs细胞内呈现黄绿色荧光，周围未被感染的细胞不被着色或颜色很淡。在放大200X或400X时，可见被感染细胞核着色，未被感染的细胞不着色但可显出细胞轮廓。DB 32/T 24472013 3 A A 附 录 A（规范性附录）抗凝剂的配制 肝素溶液：加生理盐水将肝素粉稀释成每毫升200单位，贮存备用，采血时使每毫升含肝素15-20单位。DB 32/T 24472013 4 B B 附 录 B（规范性附录）pH7.2、0.01mol/L PBS 的配制 PBS配制步骤：a)配制25PB:称取2.74g磷酸氢二钠和0.79g磷酸二氢钠加蒸馏水至100mL;b)配制1PBS:量取40mL 25PB,加入8.5g氯化钠,加蒸馏水至1000mL;c)用氢氧化钠或盐酸调pH至7.2;d)高压蒸汽灭菌或过滤除菌;e)PBS一经使用,于4保存不超过3周。_
