1、ICS 11.220CCS B 41DB32江苏省地方标准DB 32/T 40002021牛结核病诊断技术（-干扰素体外 ELISA法）Diagnostic Technique for Bovine Tuberculosis by Interferon-gamma ELISA Assay2021-02-03 发布2021-03-03 实施江苏省市场监督管理局发 布DB32/T 4000-2021I目次前言.1 范围.12 规范性引用文件.13 术语和定义.14 原理.25 试剂及仪器.26 检测方法.27 质量控制.38 结果判定.49 安全措施.4附录 A（资料性）外周抗凝血培养所需材料.5
2、附录 B（资料性）夹心 ELISA 所需试剂和材料.6附录 C（资料性）检测所需仪器.7附录 D（规范性）检测所用试剂的配制.8DB32/T 4000-2021II前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由扬州大学提出。本文件由江苏省畜牧业标准化技术委员会归口。本文件起草单位：扬州大学、江苏省动物疫病预防控制中心。本文件主要起草人：焦新安、陈祥、徐正中、潘志明、陈昌海、殷月兰。DB32/T 4000-20211牛结核病诊断技术（-干扰素体外 ELISA 法）1范围本文件规定了牛结核病诊断技术（-干扰素体外ELISA法）的试剂及
3、仪器、检测方法、质量控制和结果判定等。本文件适用于牛结核病诊断。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 18645动物结核病诊断技术GB 19489实验室生物安全通用要求GB/T 32945牛结核病诊断体外检测干扰素法3术语和定义本文件没有特别需要界定的术语和定义。4原理感染牛分枝杆菌的牛，其T淋巴细胞已被牛分枝杆菌致敏并产生免疫记忆。当体外再次遇到牛分枝杆菌特异性抗原（结核菌素）刺激时，牛外周血中淋巴细胞被激活并大量释放-干
4、扰素，而未被感染的牛则不会分泌或低水平分泌-干扰素。通过双单克隆抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）检测特异性-干扰素浓度水平，即可诊断牛结核病。5试剂及仪器5.1 试剂外周抗凝血培养所需材料参见附录 A。夹心 ELISA 所需试剂和材料参见附录 B。5.2 仪器检测所需仪器参见附录C。DB32/T 4000-202126检测方法6.1试剂配制检测所需试剂的配制见附录D。6.2样品采集与处理6.2.1无菌采集牛尾静脉血 3 mL4 mL，加入至含肝素锂或肝素钠的抗凝血真空管中，轻轻颠倒 2 次3 次使血液和抗凝剂混合均匀。室温（225）运送至实验室并在采血后 24 h 内进行培养。6.2.2
5、分装前轻轻颠倒抗凝血真空管，充分混匀血液样品。将抗凝血无菌加入至 48 孔细胞培养板，每头牛抗凝血分装 3 孔，1.0 mL/孔（可参考表 1）。6.2.3在每头牛的 3 孔抗凝血样品中，分别无菌加入 67 L PBS、67 L 禽型 PPD 溶液和 67 L 牛型 PPD 溶液（可参考表 1），用微量振荡器低速充分振荡，使刺激抗原与抗凝血完全混合。6.2.4盖上细胞培养板盖，避免液体挥发。将含有抗凝血和刺激抗原的 48 孔细胞培养板在 37湿温培养箱中孵育 16 h24 h。6.2.5使用移液器小心吸取上层血浆 200 L300 L，转至 1.5 mL 离心管中。吸取血浆时应尽量避免吸入红细
6、胞。表 1.抗凝血样品和刺激原加入到 48 孔细胞培养板（竖排放置）动物动物 1PBSA1禽型 PPDA2牛型 PPDA3PBSA4禽型 PPDA5牛型 PPDA6动物动物 2动物动物 3PBSB1禽型 PPDB2牛型 PPDB3PBSB4禽型 PPDB5牛型 PPDB6动物动物 4动物动物 5PBSC1禽型 PPDC2牛型 PPDC3PBSC4禽型 PPDC5牛型 PPDC6动物动物 6动物动物 7PBSD1禽型 PPDD2牛型 PPDD3PBSD4禽型 PPDD5牛型 PPDD6动物动物 8动物动物 9PBSE1禽型 PPDE2牛型 PPDE3PBSE4禽型 PPDE5牛型 PPDE6动物
7、动物 10动物动物 11PBSF1禽型 PPDF2牛型 PPDF3PBSF4禽型 PPDF5牛型 PPDF6动物动物 12动物动物 13PBSG1禽型 PPDG2牛型 PPDG3PBSG4禽型 PPDG5牛型 PPDG6动物动物 14动物动物 15PBSH1禽型 PPDH2牛型 PPDH3PBSH4禽型 PPDH5牛型 PPDH6动物动物 166.3酶联免疫吸附试验6.3.1溶解阳性、阴性对照冻干粉，配制 1PBST 洗涤液，按“操作注意事项”平衡其他试剂。6.3.2取商品化已包被有-干扰素单克隆抗体的酶标板（根据样品多少，可拆开分次使用），先加入 50 L样品稀释液至各孔中，再加入 50 L
8、 血浆样品及阳性对照、阴性对照至各孔中，轻轻振匀孔中样品，贴上封板膜，37孵育 2 h。6.3.3弃去孔内液体。使用 1PBST 洗涤液洗板 5 次，300 L/孔。每次静置 1 min 后弃洗涤液，洗涤完毕后在吸水纸上拍干。DB32/T 4000-202136.3.4用酶标抗体稀释液按 1：100 稀释酶标抗体（现配现用）。在每孔中加入 100 L 新鲜配制的酶标抗体，贴上封板膜，37孵育 2 h。6.3.5使用 1PBST 洗涤液洗板 5 次，300 L/孔。每次静置 1 min 后弃洗涤液，洗涤完毕后在吸水纸上拍干。6.3.6每孔加入 100 L 底物显色液，贴上封板膜，37避光显色 1
9、0 min。6.3.7按照加入底物显色液的顺序和时间间隔每孔加入 50 L 终止液，15 min 内在酶标仪上测定OD450nm。6.4操作注意事项6.4.1由于本试验需要活的淋巴细胞，因此需要使细胞损伤降至最低。任何情况下不应将抗凝血贮存于冰箱中。6.4.2刺激后的血浆样品如不直接进行酶联免疫吸附试验，血浆可在 28贮存 7 天，在-20可贮存 6 个月。贮存前，每个贮存管必须用合适的盖子密封。应在样品架上标记日期、操作者的首字母、管内容物、动物编号和牛群细节等相关信息。检测前，样品应恢复至室温并充分混匀。6.4.3除酶标抗体外，试剂盒使用前各组份应平衡至室温，使用后即放回 28。6.4.4
10、不同批号试剂盒的试剂组分不得混用，使用过程中各试剂组份应避免交叉污染。6.4.5底物显色液避免暴露于强光和接触氧化剂。6.4.6终止液中含有 H2SO4，使用时注意不要接触到身体和衣物。6.4.7抗体包被酶标板拆封后应避免受潮或沾水（每次将剩余的抗体包被酶标板用封口袋扎紧后尽快置于 28）。6.4.8阳性对照和阴性对照冻干粉用灭菌纯水稀释并使用后，尽快置于 28保存。6.4.9待检血浆样品数量较多时，可先使用样品稀释液稀释完所有待检血浆，再将稀释好的血浆转移到反应板，保证反应时间一致。6.4.10严格按照操作说明书要求进行，操作过程中移液、定时和洗涤等过程应精确。7质量控制在判定结果前必须检查
11、对照样品的结果，确定阴性对照和阳性对照的OD450nm值在规定范围之内：阴性对照OD450nm值范围为0.00.15。阳性对照OD450nm值范围为0.73.0。如果有一条标准不符合，试验是无效的，应重新进行检测。8结果判定8.1计算每个样品 PBS 刺激组、禽型 PPD 刺激组和牛型 PPD 刺激组的 OD450nm值。如果做重复孔，应计算每头牛所有样品 PBS 刺激组、禽型 PPD 刺激组和牛型 PPD 刺激组的平均 OD450nm值。8.2结果判定标准阳性判定标准：牛型 PPD 刺激组 OD450nm值-PBS 刺激组 OD450nm值0.1 且牛型 PPD 刺激组 OD450nm值-禽
12、型 PPD 刺激组 OD450nm值0.1。阴性判定标准：牛型 PPD刺激组OD450nm值-PBS 刺激组 OD450nm值0.1，或牛型PPD 刺激组OD450nm值-PBS 刺激组 OD450nm值0.1 且牛型 PPD 刺激组 OD450nm值-禽型 PPD 刺激组 OD450nm值0.1。DB32/T 4000-202149安全措施按照GB/T 18645和GB 19489执行。DB32/T 4000-20215附录A（资料性）外周抗凝血培养所需材料A.1肝素锂或肝素钠真空抗凝管；A.25 mL 或 10 mL 动物采血器；A.3无菌 48 孔细胞培养板；A.4牛型 PPD 溶液（2
13、.5 mL/瓶）；A.5禽型 PPD 溶液（2.5 mL/瓶）；A.6100 L、1000 L 枪头；A.7用于贮存血浆的 1.5 mL 离心管；A.896 孔板架。DB32/T 4000-20216附录B（资料性）夹心 ELISA 所需试剂和材料B.1酶标板（包被牛-干扰素单克隆抗体，含 0.1%ProClin 300）；B.2牛-干扰素阳性对照冻干粉（含 0.1%ProClin 300）；B.3牛-干扰素阴性对照冻干粉（含 0.1%ProClin 300）；B.4样品稀释液（血浆稀释缓冲液，含 0.1%ProClin 300）；B.5PBST 洗涤液（20）（含 0.1%ProClin 3
14、00）；B.6酶标抗体（含 0.1%ProClin 300）；B.7酶标抗体稀释液（含 0.01%的硫柳汞）；B.8底物显色液（TMB（3,3,5,5-四甲基联苯胺）溶液）；B.9终止液（0.5M H2SO4）；B.10灭菌纯水（用于溶解阳性对照、阴性对照冻干粉）；B.11蒸馏水（用于稀释洗液）；B.12酶联免疫吸附试验所需的试剂、反应槽、封板膜和枪头。DB32/T 4000-20217附录C（资料性）检测所需仪器C.137湿温培养箱；C.2精密可调移液器（100 L、1000 L）；C.31 mL、5 mL、10 mL 的移液器；C.4100 mL、1 L、2 L 的量筒；C.512 道移液
15、器（50 L300 L）；C.6微量振荡器（可选）；C.7洗板机（可选）；C.837水浴锅；C.9酶标仪（含 450nm 滤光片）。DB32/T 4000-20218附录D（规范性）检测所用试剂的配制D.1刺激抗原牛型 PPD 溶液（10000 IU/mL）和禽型 PPD 溶液（7500 IU/mL）在使用前彻底混匀，2.5 mL/瓶。D.2酶标板在开封前将酶标板恢复至室温，可放置 30 min 以上。D.3阳性对照和阴性对照用 0.2 mL 灭菌纯水分别溶解阴、阳性对照冻干粉。应保证完全溶解，溶解的阳性对照、阴性对照在 28可储存 1 个月，但再次使用前应恢复至室温并充分混匀。D.4样品稀释液恢复至室温并充分混匀，用作血浆稀释缓冲液。D.5酶标抗体和酶标抗体稀释液酶标抗体必须一直保存于 28。酶标抗体稀释液可直接使用。按表 2 配制酶标抗体工作液，现配现用，未用完的试剂应立即丢弃。未用完的酶标抗体应立即放回至 28条件下保存。表 2 酶标抗体工作液配制表酶标板数量酶标抗体的体积酶标抗体稀释液的体积10.11 mL11 mLD.6洗涤液配制工作浓度的洗涤液，将 19 份蒸馏水加入 1 份 20 倍浓缩的洗涤液中，充分混匀。工作浓度的洗涤液可在室温贮存 2 周，未用完的 20 倍浓缩洗涤液应放回至 28条件下保存。20 倍浓缩洗液可能含有结晶盐，使用前 37重新溶解结晶。_
