1、ICS 67.050 X 04 DB34 安徽省地方标准 DB 34/T 28162017 转基因水稻品系 Bt 汕优 63 定量检测方法 微滴式数字 PCR 法 Quantitative detection of genetically modified rice Bt63 with droplet digital PCR method 文稿版次选择 2017-03-30 发布 2017-04-30 实施安徽省质量技术监督局发 布 DB34/T 28162017 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。本标准由安徽省检验检疫科学技术研究院提出。本标准由安徽省动植物
2、检验检疫标准化技术委员会归口。本标准主要起草单位：安徽省检验检疫科学技术研究院、合肥市动物卫生监督所 本标准主要起草人：陈雪娇、宗凯、李云飞、孙娟娟、杨磊、郑海松、余晓峰、姚剑。DB34/T 28162017 1 转基因水稻品系 Bt 汕优 63 定量检测方法 微滴式数字 PCR 法 1 范围 本标准规定了转基因水稻 Bt 汕优 63 品系微滴式数 PCR 定量检测方法。本标准适用于转基因水稻 Bt 汕优 63 品系微滴式数字 PCR 定量检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括
3、所有的修改单）适用于本文件。GB/T 19495.3 转基因产品检测 核酸提取纯化方法 GB/T 19495.7 转基因产品检测 抽样和制样方法 SN/T 2584 水稻及其产品中转基因成分检测 实时荧光PCR法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 转基因 transgene 将物种本身不具有的、来源于其他物种的功能 DNA 序列，通过生物工程技术，使其在该物种中进行表达，以便使该物种获得新的品种特征。3.2 微滴式数字 PCR droplet digital PCR 在传统 PCR 扩增前对样品进行微滴化处理，将含有核酸分子的反应体系分成成千上万个纳升级的微滴，其中每个微滴不
4、含或含有一个至数个待检核酸靶分子。经 PCR 扩增后，逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为 1，没有荧光信号的微滴判读为 0，根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度。3.3 SPS 基因 Sucrose Phosphate Synthase gene 蔗糖磷酸盐合成酶基因（Sucrose Phosphate Synthase gene）。该基因可用于判定水稻的物种特异性，在水稻单倍体基因组中为单拷贝。3.4 品系特异基因 Event Specific Gene DB34/T 28162017 2 利用生物工程技术转入的其他生物基因，使该生物品种表现新的
5、生物学性状。3.5 定量检测 Quantitative detection 本标准中所述“定量”及“含量”指样品 DNA 中品系特异性基因拷贝数与 SPS 基因拷贝数之比。4 方法和原理 对于已知或经检测为转基因水稻品系 Bt 汕优 63 的样品，采用微滴式数字 PCR 双通道法，在同一反应管内同时扩增 SPS 基因与品系特异性基因，依据检测所得样品 DNA 溶液中的品系特异性基因拷贝数与水稻物种特异性基因（SPS 基因拷贝数）之比，得到样品中转基因水稻品系 Bt 汕优 63 的含量。5 仪器设备和主要试剂耗材 5.1 仪器设备 微滴发生与分析系统，PCR 仪，样品粉碎仪或研磨机，天平（感量
6、0.01 g），水浴锅或恒温孵育器，冷冻离心机，高压灭菌锅，涡旋振荡器，生物安全柜，pH 计，核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计，微量移液器（2 L、10 L、100 L、200 L、1000 L），8 道移液器（20200 L）。5.2 主要试剂耗材 微滴式数字 PCR 系统配套试剂及耗材，包括 2ddPCR 反应预混夜，微滴发生油，微滴分析油，微滴发生板，胶条，铝覆膜，PCR 反应板等。引物和探针由商品化公司生产。6 检测步骤 6.1 取样和制样 按照 GB/T 19495.7 中规定的方法执行。6.2 样品 DNA 的提取与纯化 按照 GB/T 19495.3 附录C 中 CTAB 法或采用
7、具有相同效果的 DNA 磁珠提取试剂盒进行 DNA 提取。6.3 DNA 浓度测定和定量 样品 DNA 用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测定 260 nm 和 280 nm 处吸收值，分别计算核酸的纯度和浓度，计算公式如下：DNA 纯度以 OD260/OD280 比值表示。DNA 浓度=50OD260 mg/mL。DNA 的纯度比值应在 1.71.9 之间，浓度调整至 50100 ng/L。6.4 微滴式数字 PCR 扩增 DB34/T 28162017 3 样品经 SN/T 2584 方法检测判定为转基因水稻品系 Bt 汕优 63 后，用微滴式数字 PCR 法进行检测。6.4.1 引物与探针
8、序列 见表1。表1 检测所需引物和探针 引物/探针 序列（5-3）引物/探针 序列（5-3）产物大小(bp)SPS 基因 Forward ATG AGA TGT CCG CTG GCA ATG 109 Reverse TCT GAC TGC TTG TGA TGC TTG G Probe HEX-AAG CGT CCT CAC CAC TGT CCT GAA GC-BHQ1 Bt 汕优 63 品系特异序列 Forward AGA GAC TGG TGA TTT CAG CGG G 119 Reverse GCG TCC AGA AGG AAA AGG AAT A Probe FAM-ATC T
9、GC CCC AGC ACT CGT CCG-BHQ1 6.4.2 PCR 反应体系 见表2。表2 微滴式数字 PCR 反应体系 名称 终浓度 2ddPCR Supermix for Probe 1 SPS-F 800nM SPS-R 800nM SPS-P 500nM Bt 汕优 63 品系特异序列-F 800nM Bt 汕优 63 品系特异序列-R 800nM Bt 汕优 63 品系特异序列-P 500nM DNA 模板 100300 ng 超纯水 补足至 22 L 注：反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。6.4.3 微滴发生 反应体系配制好后，加入微滴发生板
10、的样品孔中（避免产生气泡），在相应微滴发生板的油孔中加入 70 L 微滴发生油，装好胶条，置于微滴发生器中形成微滴。之后，将发生好的微滴用 8 道移液器转移至 0.2 mL PCR 反应管中（缓吸缓放），用配套铝箔加热封口后，置于 PCR 仪上进行 PCR 反应。6.4.4 微滴式数字 PCR 反应程序 微滴式数字 PCR 反应参数为：95/10min；94/30s，60/60s，45 个循环；98/10min。Ramp rate 1/s。注：以上参数可根据不同型号 PCR 仪和反应体系作适当调整。6.4.5 仪器检测通道的选择 DB34/T 28162017 4 设置 PCR 反应管荧光信号
11、收集条件，应与探针标记的报告基团一致。具体设置方法可参照仪器使用说明书。6.4.6 实验对照的设立 每次检测必须设立 3 个对照：阳性对照，为水稻转基因品系 Bt 汕优 63 1标准品基因组 DNA；阴性对照，非转基因水稻基因组 DNA；空白对照，PCR 反应的空白对照（以水代替 DNA 模板）。7 结果分析与计算 7.1 质量控制 7.1.1 每个样品设置 2 个提取平行重复，每个提取平行重复设定 4 个扩增平行重复。7.1.2 每个反应管中的微滴发生总数必须大于 9000 个。7.1.3 三个对照的扩增结果应当符合以下条件：空白对照：品系特异基因、SPS 基因均没有扩增；阴性对照：品系特异
12、基因没有扩增，SPS 基因有扩增；阳性对照：品系特异基因和 SPS 基因均有扩增。上述指标有一项不符合者，说明 PCR 反应不正常，应分析原因调整后重做。7.1.4 每个提取平行重复样的 4 次测试结果中剔除相对标准偏差最大的一个数值，其余 3 个数值取平均值作为该平行重复样的测得值。7.2 结果计算 7.2.1 提取平行重复样中转基因水稻品系 Bt 汕优 63 成分含量 7.2.1.1 每管中转基因水稻品系 Bt 汕优 63 成分（S）含量计算公式（1）如下：100YXiS（）.(1)式中：X 品系特异性序列拷贝数 Y 内源基因拷贝数 7.2.1.2 每个提取平行重复样中转基因水稻品系 Bt 汕优 63 成分含量（Ai）如公式（2）：Ai=（S1+S2+S3）/3.(2)7.2.2 样品中转基因水稻品系 Bt 汕优 63 成分含量 样品的转基因水稻品系 Bt 汕优 63 成分含量（T）为 2 个提取平行重复样品的转基因成分含量 Ai平均值，公式（3）如下：T（）=（A1+A2）/2.(3)8 结果表述 DB34/T 28162017 5 该样品中检出转基因水稻 Bt 汕优 63 品系，含量为。9 定量下限 本标准所述方法的定量检测下限为 0.1。_
