1、ICS 67.100.01 X 16 DB37 山东省地方标准 DB 37/T 35312019 羊奶中羊、大豆源性成分的定性检测方法 实时荧光 PCR 法 Identification of caprine，sheep and glycine derived materials in goat or sheep milk Real-time fluorescent PCR method 2019-03-21 发布 2019-04-21 实施 山东省市场监督管理局 发 布 DB37/T 35312019 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 原理
2、.1 5 试剂和材料.1 5.1 试剂.2 5.2 材料.2 6 仪器设备.2 7 检测用引物和探针.3 8 试验步骤.3 8.1 取样.3 8.2 DNA 提取.3 8.3 实时荧光 PCR 反应.3 9 试验数据处理.4 9.1 PCR 有效性判定.4 9.2 检测结果分析和表述.4 10 检测过程中防止交叉污染的措施.4 附 录 A（规范性附录）实时荧光定性 PCR 引物/探针序列、反应体系和结果判定.5 附 录 B（资料性附录）目的基因扩增靶标参考序列.7 DB37/T 35312019 II 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并监督
3、实施。本标准由山东省畜牧专业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省农业科学院生物技术研究中心。本标准主要起草人：张全芳、范阳阳、刘艳艳、胡悦、陈雪燕、刘国霞、陈淑娟、谷玉霞、王俊燕、步迅。DB37/T 35312019 1 羊奶中羊、大豆源性成分的定性检测方法 实时荧光 PCR 法 1 范围 本标准规定了羊奶产品中羊、大豆源性成分的实时荧光定性PCR检测方法。本标准适用于生鲜羊奶、灭菌液态羊奶、羊奶粉等羊奶制品中羊、大豆源性成分的定性检测。本方法的检出限为0.1%。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的
4、引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 羊源性 本标准提及的羊源性成分为山羊和绵羊。3.2 实时荧光PCR real-time fluorescence PCR 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监控整个PCR进程，对未知模板进行定性或定量分析。3.3 Ct值 cycle threshold 每个实时荧光PCR反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。4 原理 以山羊和绵羊线粒体16SrDNA
5、，大豆内源基因Lectin为靶基因，在不同物种间保守区设计通用引物，在可变区设计物种特异性探针，采用TaqMan实时荧光PCR技术进行扩增，根据PCR扩增反应的荧光信号及循环阈值，判定羊和大豆的源性成分。5 试剂和材料 DB37/T 35312019 2 除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和符合GB/T 6682规定的一级水。5.1 试剂 5.1.1 氯化钠（NaCl）。5.1.2 浓盐酸（HCl）。5.1.3 三羟甲基氨基甲烷（Tris base）。5.1.4 二水乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA2H2O）。5.1.5 十二烷基硫酸钠（SDS）。5.1.6 磷酸盐缓冲液（PBS）
6、。5.1.7 异硫氰酸胍（GuSCN）。5.1.8 硅珠（silica）。5.1.9 蛋白酶冻干品。5.1.10 聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）。5.1.11 无水乙醇。5.1.12 Chelex-100 树脂。5.2 材料 5.2.1 生理盐水：称取 0.85 g 氯化钠加 20 mL 水溶解，转移至 100 mL 容量瓶中，加水定容至刻度，103.4 KPa 蒸汽压（121）灭菌 20 min，降至室温，4 保存备用。5.2.2 20 mg/mL 蛋白酶 K 溶液：称取 0.2 g 蛋白酶冻干品，转移至 10 mL 容量瓶中，加水定容至刻度，分装后于-20 保存。5.2.3
7、 5%的 Chelex-100：称取 5 g Chelex-100 树脂，转移至 100 mL 容量瓶中，加水定容至刻度。5.2.4 1 mol/L Tris-HCl（pH 6.4）溶液：称取 12.1 g 三羟甲基氨基甲烷置于 100 mL 烧杯中，加入80 mL 水，用浓盐酸调节 pH 至 6.4，转移至 100 mL 容量瓶中，加水定容至刻度，103.4 KPa 蒸汽压（121）灭菌 20 min，室温保存待用。5.2.5 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）溶液：称取 18.61 g 二水乙二胺四乙酸二钠置于 100 mL 烧杯中，加入 80 mL 水，用 10%的氢氧化钠溶液
8、，调节 pH 至 8.0，转移至 100 mL 容量瓶中，加水定容至刻度，103.4 KPa 蒸汽压（121）灭菌 20 min，室温保存待用。5.2.6 10%SDS：称取 10 g 十二烷基硫酸钠溶解于 80 mL 无菌水中，转移至 100 mL 容量瓶中，加水定容至刻度，储存于灭菌过的容器中待用。5.2.7 DNA 结合液：称取 60 g 异硫氰酸胍，加入 5 mL 1mol/L Tris-HCl（pH 6.4）溶液，再加入 8 mL 0.5 mol/L 乙二胺四乙酸二钠（pH 8.0）溶液，再加入 4 mL 聚乙二醇辛基苯基醚原液（温度 60），转移至 100 mL 容量瓶中，加水定容
9、至刻度。5.2.8 TE 缓冲液：将 0.5 mL 的 10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)、0.1 mL 的 0.5 mol/L 乙二胺四乙酸二钠(pH 8.0)加入到 50 mL 的容量瓶中，调节 pH 至 8.0，转移至 50 mL 容量瓶中，加水定容至刻度，103.4 KPa 蒸汽压（121）灭菌 20 min，降至室温，4 保存备用。6 仪器设备 6.1 实时荧光定量 PCR 仪：4 通道以上。6.2 电子分析天平：感量 0.1 mg。6.3 离心机：最大离心力不小于 13 000 g。6.4 振荡型恒温金属浴：0 100。DB37/T 35312019 3 6.5
10、高压灭菌锅。6.6 低温冰箱：-20 4 。6.7 超净工作台。6.8 微量移液器：100 L1 000 L，10 L200 L，2 L20 L，0.5 L10 L。6.9 容量瓶：10 mL，50 mL，100 mL。7 检测用引物和探针 内标引物探针序列及羊和大豆的引物和特异性探针序列见附录A中表A.1。引物探针在序列中的位置参见附录B。8 试验步骤 8.1 取样 首先收集白细胞：取液态羊奶2 mL，或者奶粉20 mg溶于2 ml无菌水中，每个样品设立2个平行样，将样品于4、2 500 g离心30 min；弃去离心管的上层乳脂和中间层乳液，保留其底部沉淀，向底部加l mL pH 7.4灭菌
11、的PBS缓冲液，将底部沉淀吹打悬浮并转移至1.5 mL的离心管中，离心力3 500 g，常温离心10 min，弃去上层液体，保留底部沉淀。8.2 DNA 提取 8.2.1 向收集的白细胞中加入 280 L 5%的 Chelex-100 和 20 L 20 mg/ml 蛋白酶 K，56 保温 30 min以上；高速震荡 5 s10 s，100 煮沸 8 min；高速震荡 5 s10 s，13 000 g 离心 3 min，转移上清液至离心柱中，13 000 g 离心 1 min，收集上清液。8.2.2 向收集液体中加入 20 L 硅珠悬浮液和 600 L DNA 结合液，充分混匀，65 水浴 1
12、5 min，中间反转 35 次；室温放置 5 min，中间反转 35 次；4 000 g 离心 1 min，弃上清，留管底沉淀。8.2.3 加入 500 L 70%乙醇，于 8 000 g 离心 1 min，重复此步骤 2 次；加入 500 L 无水乙醇；吹打悬浮，8 000 g 离心 1 min，弃上清。8.2.4 于 8 000 g 离心 30 s，吸走残余液体，室温干燥 10 min，使残余乙醇挥发干。8.2.5 加 100 L TE 缓冲液溶解 DNA，加入 1 L RNA 酶溶液，55 水浴 5 min，8 000 g，离心 1 min，吸取上清液转移至新的离心管中，-20 保存备用
13、。8.2.6 紫外分光光度计检测提取的 DNA 浓度与纯度，测定 260 nm 和 280 nm 处吸光值 A260/A280，比值在1.71.9 之间，DNA 浓度约为 0.1 ng/L50 ng/L。8.3 实时荧光 PCR 反应 8.3.1 试样实时荧光 PCR 检测 多重实时荧光PCR：进行羊和大豆源性成分多重实时荧光PCR，PCR反应体系中包含羊和大豆2个物种源性的特异探针，并加入内标质控体系。反应体系见附录A中表A.2。8.3.2 对照实时荧光 PCR 反应体系 每个PCR反应设置3次平行。在试样PCR反应的同时，设置空白对照、阴性对照和阳性对照：a)空白对照：以水作为空白对照；b
14、)阴性对照：以 2 个动物之外的其他基因组 DNA 为阴性对照；DB37/T 35312019 4 c)阳性对照：将羊和大豆 2 种动物和植物基因组 DNA 等量混匀作为阳性对照。8.3.3 实时荧光 PCR 反应体系配制 按照附录A中表A.2依次加入试剂，配制PCR反应体系，混匀离心分装至PCR反应管中，加入模板DNA，3 000 g离心1 min，取出PCR管，放入荧光定量PCR仪中。8.3.4 实时荧光 PCR 反应程序 95 预变性3 min；95 变性10 s，62 退火延伸35 s，40个循环。9 试验数据处理 9.1 PCR 有效性判定 空白对照、阴性对照和阳性对照全部满足下述条
15、件，表明PCR体系有效：a)空白对照：无 FAM 和 ROX 荧光信号，或 Ct 值40.0，有 CY5 质控探针荧光信号，且 Ct 值35.0；b)阴性对照：无 FAM 和 ROX 荧光的 S 型扩增曲线，或 Ct 值40.0，有 CY5 质控探针的荧光信号，且 Ct 值35.0；c)阳性对照：有 FAM、ROX 和 CY5 荧光信号的 S 型扩增曲线，且 Ct 值35.0。否则判定为PCR无效。9.2 检测结果分析和表述 9.2.1 在 PCR 反应体系有效的情况下，当有 FAM、ROX、CY5 荧光扩增曲线出现，若 Ct 值35.0，则判定样品中检出相应的羊或大豆源性成分；若无 S 型扩
16、增曲线，则判定样品中未检出相应的源性成分。在 PCR 反应体系有效的情况下，当有 FAM、ROX、CY5 荧光扩增曲线出现，但 35.0Ct 值40.0，则需要加大模板量进行 PCR 反应。若再次扩增后的 Ct 值40.0，则判定样品中检出相应的源性成分；若再次扩增后无 S 型扩增曲线，则判定样品中未检出相应的源性成分。9.2.2 对样品检测结果的判定，见附录 A 中表 A.3。10 检测过程中防止交叉污染的措施 防治污染的措施按GB/T 27403规定执行。DB37/T 35312019 5 A A 附 录 A（规范性附录）实时荧光定性 PCR 引物/探针序列、反应体系和结果判定 A.1 实时荧光定性PCR引物和探针序列 实时荧光定性PCR引物和探针序列见表A.1。表A.1 实时荧光定性 PCR 引物和探针序列 引物探针名称 缩写 序列（5-3）扩增片段（bp）大豆引物-上游 Lectin-F CTCTACTCCACCCCCATCCACAT 128 大豆引物-下游 Lectin-R AGAAAGAAGGCAAGCCCATCTG 羊源性引物-上游 UNF AAGACGAGAAGACCG
