1、ICS 65.150B 51DB37山东省地方标准DB 37/T 22922013刺参（种质）2013-04-01 发布2013-05-01 实施山东省质量技术监督局发 布DB37/T 22922013I前言本标准按GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由山东省海洋与渔业厅提出。本标准由山东省渔业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省海洋水产研究所。本标准主要起草人：孙国华、刘丽娟、任利华、姜向阳、宋秀凯、孙伟、姜会超。DB37/XXXXXXXXX1刺参（种质）1范围本标准规定了刺参（Apostichopus japonicus）的名称与分类、主要形态特征、生长与繁殖、分子遗传
2、学特性及检测方法。本标准适用于刺参的种质检测与鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 18654.1养殖鱼类种质检验 第1部分 检验规则GB/T 18654.2养殖鱼类种质检验 第2部分 抽样方法3名称与分类3.1学名刺参（Apostichopus japonicus）。3.2分类棘皮动物门(Echinodermata)，海参纲（Holothuroidea），楯手目（Aspidochirota），刺参科（Stichopodidae），仿刺参属（A
3、postichopus）。4主要形态特征4.1外部形态特征4.1.1体呈扁的圆筒形，两端稍细，横断面略呈四角形。成参体长一般 20 cm40 cm。口在前端，偏于腹面，肛门在后端，偏于背面。口周生有 20 个楯状触手。背、侧面有大小不一、排列不规则的 4 列纵向肉刺。体色呈黄褐、黑褐、绿褐、纯白或灰白等。体壁分为 5 个步带区和 5 个间步带区，彼此相间排列。腹面平坦，管足密集，排成不规则的 3 条纵带。4.1.2刺参外部形态见图 1。DB37/XXXXXXXXX2图 1刺参外部形态4.2内部构造特征4.2.1体壁由角质层、表皮、结缔组织和无数小型骨片组成。4.2.2肌肉层由环肌和纵肌组成，外
4、层为环肌，内层为纵肌，纵肌5束。4.2.3消化系统由口、咽、食道、胃、肠和排泄腔组成。4.2.4循环系统由血管、血窦和围血系统组成，血液透明呈淡褐色。4.2.5石灰环咽部周围有由5 个辐片和5 个间辐片构成的石灰环。4.2.6波里氏囊体内具有一呈圆形、卵圆形或长瓶形的波里氏囊。5生长与繁殖5.1生长通常在人工养殖条件下不同年龄组刺参的体长和体重情况见表1。表 1不同年龄组刺参全长和体重的实测值年龄，龄12345体长，mm427892164156230196274205346体重，g7.425.778.4255.2238.1453.5343.9565.6384.9561.05.2繁殖DB37/X
5、XXXXXXXX35.2.1性成熟年龄刺参雌雄异体，雌性和雄性个体均在2龄左右性成熟。5.2.2性腺发育周期刺参的生殖周期为一个周年，分为以下5个周期：a)休止期：性腺呈透明细丝状，量极少；b)增殖期：性腺多呈无色透明或淡黄色；c)生长期：包括发育 1 期和 2 期。发育 1 期性腺逐渐增粗，分支增多，呈杏黄或浅橘红色。发育2 期性腺迅速发育，颜色变深，雌雄明显可辨；d)成熟期：精巢呈乳黄色，卵巢呈橘红色、半透明状，卵粒清晰可见；e)排放期：出现自然排精、产卵现象。排放期后性腺退化进入休止期。5.2.3产卵量成熟雌参可排卵1 次3 次，可持续30 min以上，产卵量一般在100 万粒200 万
6、粒，大个体可超1000 万粒。6分子遗传学特性6.1微卫星位点6.1.1刺参群体 30 个个体中 5 个微卫星位点 PCR 扩增多态图谱见图 2、图 3、图 4、图 5 和图 6，微卫星位点扩增引物及条件见 7.3.1。图 2微卫星位点 Ajssr01 扩增图谱图 3微卫星位点 Ajssr02 扩增图谱DB37/XXXXXXXXX4图 4微卫星位点 Ajssr03 扩增图谱图 5微卫星位点 Ajssr04 扩增图谱图 6微卫星位点 Ajssr05 扩增图谱6.1.25 对微卫星引物在刺参群体中共扩增获得 23 个等位基因，每个微卫星座位检测到的等位基因数为 3 个7 个。群体的观测杂合度的平均
7、值为 0.4759，多态信息含量平均值为 0.52493。6.216SrRNA 序列6.2.1采用 PCR 技术对刺参线粒体 16SrRNA(核糖体 16SrRNA)基因片段进行 PCR 扩增，引物序列见7.3.2.2，并将获得序列进行测序，获得以下长度为 570bp 的核苷酸序列：TCGCCTTGGTTTACAAAAACATAGCCCCACGAACTTCATATGTGGGGTGCAGCCTGCCCAGTGGAATTTATTCTAAACGGCCGCGGTATTTTGACCGTGCAAAGGTAGCATAATCACTTGTCTCTTAAATGGGGACCTGTATGAATGGCTTTTCACTC
8、TTTCACTGTCTCTCTTCCCTCCCTCCTAATCTTCTAATCACGTGAAGAAGCGTGAACAAATAAGAAAGACGAGAAGACCCTGTCGAGCTTAAGCTAACCCTGAAATGTCGTCTACCTTTTTTCTTAGAAAGAGGTAAATTTCAGATAAAGTTTTGGTTGGGGCAACCGTGGAGAAAAAGAATCCTCCAGTTAGTTAGGAAGAAAACCTTTCACCTAAAAAATTTAGCGACCCAGTTACTCTGGTAAACGGAAAAAGTTACCGCAGGGATAACAGCGTTATCTTCTCTAAGAGCCCATATT
9、GACGAGAAGGATTGCGACCTCGATGTTGGATTGGGGTAACCAAAGGGTGTAGCAGCTCTTTAAGGTTGGACTGTTCGTCCATTAACTCCCTACATGATCTGAGTTCAAAACCGGA。7检测方法DB37/XXXXXXXXX57.1抽样按照GB/T 18654.2规定执行。7.2体长、体重检验方法暂养于的干净海水中30 min以上，在无刺激自然伸展状态下测量刺参头至尾为体长；刺参从海水中捞出，静置10 min且排出腹腔大量海水后，以吸水滤纸除去表面水分，称量刺参体重。7.3分子遗传学特性分析7.3.1微卫星位点分析7.3.1.1DNA 的提取取纵肌
10、100 mg剪碎后，放入600 L裂解液，55 水浴消化至组织、碎块完全裂解。裂解液分别用等体积的饱和酚、酚：三氯甲烷(1：1)、三氯甲烷：异戊醇(24：1)抽提，加入2倍体积的无水乙醇和终浓度10%的乙酸钠离心沉淀DNA，最后用70%的乙醇洗2 次后晾干。裂解液配方见附录A。7.3.1.2微卫星位点引物序列微卫星位点引物序列见表2。表 2微卫星位点引物序列序列号引物序列Ajssr 01F:TGC AAC GTT GAT GTC ATG AGCR:GAG ACC TAG GCA CTA TAA TTC CAjssr02F:ACT TGC TAC TTT GTT CAA CTG CR:GGA G
11、GT ACA AAA GAA AGA CAG GAjssr 03F:CAA ACG CAT ACA ATT ACA CAR:CGA TCG ATA GTC CTC AAT CAjssr 04F:GCA GGA GGA TCT AAA ATA CATR:ATC GAA CAC AAC ACA ACA CTT ATC7.3.1.3反应条件95 预变性6 min；94 变性50 s，54 退火温度反应50 s，72 延伸50 s，30 个循环；之后72 5 min，4 保温。反应液配方见附录A。7.3.1.4电泳检测扩增产物经10%(w/v)聚丙烯酰胺凝胶电泳（恒功率60 W），硝酸银染色并检测其多
12、态性。聚丙烯酰胺凝胶及染色液配方见附录B。7.3.2线粒体 16SrRNA 序列7.3.2.1DNA 的提取同7.3.1.1。7.3.2.2引物序列DB37/XXXXXXXXX616Sf：5-CGCCTGTTTAACAAAAACAT-3；16Sr：5-CCGGTCTAGACTCAGATCATG-3。7.3.2.3反应条件以提取的DNA为模板，利用两个特异性引物进行PCR扩增。PCR反应条件如下：94 变性2 min，1个循环；94 变性30 s，55 退火1 min，72 延伸1 min，35个循环；72 延伸10 min，1个循环。反应液配方见附录B。7.3.2.4片段回收、纯化与序列测定P
13、CR产物经琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收纯化目的片段，用基因自动分析仪测序，反应程序按照所使用的测序试剂盒说明书给出的规程操作，最后读出16S rDNA的序列。7.4检验规则与结果判定参照GB/T 18654.1的规定执行。DB37/XXXXXXXXX7AA附录A（规范性附录）DNA 提取裂解液和 PCR 扩增反应液组成A.1DNA提取裂解液DNA提取裂解液配制方法见表A.1。表A.1 DNA提取液配制方法名称剂量HB(10 mmol/L Tris-HCl,pH8.0；100 mmol/L EDTA)540 LSDS(十二烷基磺酸钠)(10%)60 L蛋白酶K100 gA.2扩增PCR 反应液扩增
14、PCR反应液配制方法见表A.2。表A.2 扩增PCR反应液配制方法名称剂量DNA模板50 ng100 ng10倍扩增缓冲液2.5 LMgCl2(25 mmol/L)2.0 LdNTP(10 mmol/L)O.5 L引物f(50 pmol/L)0.5 L引物r(50 pmol/L)0.5 LTaq酶(5 U/L)0.2 L超纯水配制成25 L的反应体系DB37/XXXXXXXXX8BB附录B（规范性附录）聚丙烯酰胺凝胶及银染液配方B.15 倍TBE缓冲液5倍TBE缓冲液配制方法见表B.1。表B.1 5倍TBE缓冲液配制方法名称剂量Tris 碱50 ng100 ng硼酸2.5 LEDTA2.0 L
15、超纯水定容至1L4 保存备用。B.210%过硫酸铵溶液（APS）10%过硫酸铵溶液（APS）配制方法见表B.2。表B.2 10%过硫酸铵溶液（APS）配制方法名称剂量过硫酸铵2 g超纯水20 mL溶解后分装成小管，每管500 uL，-20 保存。B.310%聚丙烯酰胺凝胶的配制（现配现用）10%聚丙烯酰胺凝胶配制方法见表B.3。表B.3 10%聚丙烯酰胺凝胶配制方法名称剂量5倍TBE5 mlAPS(10%)250 ul超纯水12.5 ml丙烯酰胺+甲叉双丙烯酰胺母液（29:1）7.5 mlTEMED25 ulB.4银染液的配制（使用前 10 min配制）银染液配制方法见表B.4。DB37/XXXXXXXXX9表B.4 银染液配制方法名称剂量硝酸银（AgNO3）1 g37%甲醛3 mL超纯水定容至1 L_
