1、ICS67.120.30B50DB21辽宁省地方标准DB 21/ T1861.32010水产生物种质检验技术规程 简单重复序列间区扩增法ISSR procedure to detect germplasm for aquaculture species 2010 - 12 - 31发布2011 - 02 - 01实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/ T1861.32010前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由辽宁省海洋水产科学研究院提出。本标准归口单位：辽宁省海洋与渔业厅。本标准起草单位：辽宁省海洋水产科学研究院。本标准主要起草人：赫崇波，李云峰，刘卫东，高祥刚，李宏
2、俊，鲍相渤。6水产生物种质检验技术规程 简单重复序列间区扩增法1 范围本标准规定了水产生物简单重复序列间区扩增法（ISSR）的原理、试剂和材料、仪器、采样、分析步骤、数据分析和结果分析。本标准适用于水产生物种质检测与鉴定等方面的种质检验工作。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GBT 18654.15-2008 养殖鱼类种质检验 第15部分：RAPD分析3 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1聚合酶链式反应（PCR）用一对寡核苷酸引物、四种脱氧核糖
3、核苷酸(dNTPs)为原料，在合适的温度、离子条件和耐热 DNA聚合酶催化下，在体外人工合成特异的DNA片段的过程。3.2 遗传多样性（genetic diversity）所有生物携带的遗传信息的总和。广义上是指种内或种间，表现在分子、细胞、个体三个水平的遗传变异度，狭义上则主要是指种内不同群体和个体间的遗传多态性程度。本标准采用其狭义概念。3.3 等位基因（allele）基因的一种变异体，在二倍体细胞内每个基因有两个等位基因，每个等位基因分别来自于各自的亲本。在一个群体中一个基因可能有许多等位基因。3.4等位基因频率（allele frequency）给定座位上某等位基因所占的比例。3.5
4、遗传杂合度（heterozygosity） 表示群体在某个座位为杂合子的比例，用于衡量标记方式的信息含量程度。3.6 平均遗传杂合度（average heterozygosity） 表示群体平均在各座位为杂合子的比例，用于衡量标记方式的信息含量程度。3.7 多态信息含量（PIC）表示后代所获得某个等位标记来自于它的父亲（或母亲）的同一个等位标记的可能性。3.8 遗传距离（genetic distance）用基因频率的函数表示的群体间遗传差异，它的最适宜的测度是单位长度DNA的核苷酸数或密码子的差数，是用来表示群体或个体之间遗传关系远近的一个量化指标，其值可以从0至无限大。群体或个体间的遗传距离
5、越小，它们之间的亲缘关系越近，反之群体或个体间的遗传距离越大，那么它们之间的亲缘关系将越远。4 原理简单重复序列间区扩增法inter-simple sequence repeat (ISSR)的基本原理是利用简单重复序列设计引物，即引物主要由14个碱基组成的重复序列，通常在引物的3端或5端加几个非重复的锚定碱基以保证引物与基因组DNA中的SSR的3或5端结合。在PCR反应中，锚定引物可引起特定位点退火，导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间DNA片段进行PCR扩增。5 试剂和材料5.1 三羟甲基氨基甲烷（Tris）饱和酚。5.2 三氯甲烷：分析纯。5.3 异戊醇：分析纯。5.4 无水乙醇。
6、5.5 20TBE缓冲液：三羟甲基氨基甲烷121g，硼酸61.7g，EDTA 7.44g，加超纯水到1L。5.6 冰乙酸：分析纯。5.7 琼脂糖：生化试剂。5.8 核糖核酸（RNA）酶：生化试剂。5.9 蛋白酶K（20 mg/mL）：生化试剂。5.10 丙烯酰胺：分析纯。5.11 甲叉双丙烯酰胺：分析纯。5.12 过硫酸铵：分析纯。5.13 硝酸银（AgNO3）：分析纯。5.14 四甲基乙二胺（TEMED）：分析纯。5.15 无水碳酸钠：分析纯。5.16 Taq DNA聚合酶（生化试剂，5 U/mL）。5.17 标准分子量Markers（100bp）。5.18 硝酸：分析纯。5.19 37%甲
7、醛溶液。5.20 乙二胺四乙酸（EDTA）。5.21 20%凝胶储存液：丙稀酰胺38.6g，双丙稀酰胺1.34g， 20TBE缓冲液10mL，加超纯水到200mL。5.22 上样缓冲液：98甲酰胺，10mM EDTA(pH8.0)，0.01溴酚蓝及二甲苯青。5.23 0.1mol/L硫代硫酸钠：将2.48g 硫代硫酸钠（Na2S2O35H2O）溶于100 ml 超纯水中。5.24 银染液：1g硝酸银溶于1L超纯水中，加入37%甲醛溶液1.5ml。5.25 显影液：3g碳酸钠溶于超纯水中，加入37%甲醛溶液1.5ml和0.1mol/L硫代硫酸钠150l。 6 仪器6.1 凝胶成像分析系统6.2
8、PCR仪6.3 低温高速离心机6.5 稳压稳流电泳仪6.7 单道可调移液器（2.5mL，10mL，20mL，100mL，200mL，1000mL）6.8 电子天平（量程0.01-300mg）6.9 水浴恒温震荡器6.10 电泳槽6.11 普通离心机6.12 紫外分光光度计6.13 超声波清洗器6.14 超纯水器6.15 北京六一仪器厂DYY-型电泳仪7 采样 7.1 样品类型7.1.1型：毛发、皮毛类（儒艮、中华白海豚、斑海豹、海龟）；7.1.2 型：肌肉、肝脏组织类（仿刺参、海胆、虹鳟、大菱鲆、鳗鲡、中国对虾、日本对虾、中华绒鳌蟹、三疣梭子蟹、皱纹盘鲍、海湾扇贝、虾夷扇贝、栉孔扇贝、文蛤、牡
9、蛎、海蜇等）；7.1.3 型：藻类（海带、裙带菜、鼠尾藻等）。7.2 采样方法7.2.1珍稀濒危动物采样应在自然保护机构、人工养殖部门等协助下进行，以不伤害个体、不破坏其生境为原则，采集其毛发、皮毛等作为样品，特殊情况（如出现受伤个体等）可酌情采取其他部位（如肌肉、肝脏等）。样品数量应不少于10个/群体。所采样品标注后，妥善存放，防止污损，做好采样记录。7.2.2普通水产生物采样随机采取正常、健康个体样品，数量不少于30个/群体。样品标注后，活体运至实验室。8 分析步骤8.1 样品固定8.1.1 型样品将样品先用70%乙醇洗1次，再用超纯水冲洗2次，-20保存备用。8.1.2 型样品从活体中直
10、接采集肌肉或脏器组织， -20冰箱直接冻存。8.1.3 型样品选取幼嫩藻尖，用毛笔在无菌海水中充分刷洗，解剖镜下观察，确定没有附生杂藻后，在无菌蒸馏水中清洗，晾干备用。8.2 DNA提取8.2.1 型样品在200L 离心管中放入14根毛发，毛囊置于离心管底部，剪去高于离心管部分的毛发，设置一个空白对照管；在每个离心管中加入15L配制好的毛囊裂解液。毛囊裂解液用1PCR缓冲液(50mmol/L KCl，10mmol/L Tris-HCl，0.01%明胶)，加MgCl2至2mmol/L，蛋白酶K 20mg/L；在PCR仪上设置一个单循环程序：65 30min，95 15min，4 10min；将上
11、一步骤中的离心管放入预热好的PCR仪中，运行该程序。程序结束后，将离心管进行瞬时离心，-20保存备用。8.2.2 型样品取-20下冻存的脏器0.2g，置于液氮中研成粉末；加DNA提取液(10mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，75mmol/L NaCl，0.5%SDS，5mmol/L EDTA)。振荡均匀后，65水浴1h；按GB/T 18654.15-2008的规定，用苯酚和氯仿方法抽提DNA；用适当50 L TE缓冲液（10mmol/L Tris-HCl pH 8.0，lmmol/L EDTA）溶解DNA，-20保存。8.2.3 型样品取鲜样品50150mg，剪成小块放入研钵中，加
12、入液氮，待样品完全冷冻后，快速、用力研磨至粉末状；将研钵放入65水浴至样品粉末刚开始融化，向研钵中加入DNA提取液(10mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，75mmol/L NaCl，0.5SDS，5mmol/L EDTA)及RNA酶、蛋白酶K共400L，用力碾磨30s。收集研磨好的组织匀浆移至1.5mL离心管中，65保温1560min，按GBT 18654.15-2008的方法，用苯酚和氯仿方法抽提DNA；水相加入0.1倍体积醋酸钠 (3mol/L，pH5.2) 和两倍体积无水乙醇沉淀；溶于50L TE缓冲液 (10mmol/L Tris-HCl pH 8.0，lmmol/L ED
13、TA)，置-20保存备用。8.3 DNA产物测定8.3.1 DNA纯度检测吸取13 L提取的DNA，用浓度12琼脂糖凝胶100V电泳 30 min，检测所提取DNA的质量。以DNA条带的分子量及有无拖尾为标准判断DNA的质量。8.3.2 DNA浓度检测8.3.2.1紫外吸收定性测试分别于260 nm波长和280 nm波长下测定产物（或产物稀释液）的紫外吸收值。确定A260A280比值在1.82.0范围内，方可正常进行后续实验。8.3.2.2 紫外吸收定量测试260nm波长下测定产物（或产物稀释液）的紫外吸收值。根据公式(1)计算DNA浓度。DNA浓度(g/mL)=A260(0.020L)稀释倍
14、数(1)式中：A260被测样品在260nm下的吸光度值 L比色池厚度，单位cm。DNA浓度在10g/mL以上，可正常进行后续实验。8.4 ISSR分析8.4.1 PCR反应按表1配制PCR反应体系，按表2设置程序进行PCR反应表1 ISSR-PCR反应体系试剂体积(mL)Buffer (10)2.5mLMgCl2 (25mmol/L)2.0mL引物P1 A (2pmol/L)0.5mL引物P1 B (2pmol/L)0.5mLdNTPs (25mmol/L)0.5mLTaq E (5U/mL)0.2mLDNA (50ng-100ng)3.0mL超纯水15.8mL表2 ISSR-PCR反应程序阶 段温 度时 间1945 min29430 s50-6030-60 s721 min25-35个循环37210 min44保存8.4.2 凝胶电泳及染色（1）模具处理与安装：清洗用作模具的玻璃板并晾干，并分别涂上亲和硅烷（主板）和剥离硅烷（耳板），安装好边条并加紧模具。（2）6聚丙烯酰胺凝胶制备：按表3配制6%聚丙烯酰胺凝胶。将凝胶液灌入模具至胶液距模具上沿0.6cm，将梳子背面插入胶液中，吸出多余胶液，室温下聚合2h。表3 6%聚丙烯酰胺变性凝胶配制药品与试剂体积20胶储存液1mL20
