1、中华 人 民共 和 国国 家 标 准食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂4 7 8 9.2 8-9 4GB 4 7 8 9.2 8 8 4曲储 Mi c r o b i o l o g i c a l e x a mi n a t i o n o f f o o d h y g i e n eS t a i n n i n g m e t h o d s,c u l t u r e me d i u ms a n d r e a g e n t s1 主题内容与适用范围 本标准规定了各种染色法、培养基和试剂。本标准适用于食品和食物中毒样品中各类微生物的检验。2 染色液配制及染色法2.1 美
2、蓝染色法2.，.，吕氏碱性美蓝染色液 美蓝0.3 g 9 5%乙醇3 0 mL 。0 1%氢氧化钾溶液1 0 0 m L 将美蓝溶解于乙醉中，然后与氢氧化钾溶液混合。2.，.2 染色法 将涂片在火焰上固定，待冷。滴加染液，染 1-3 m i n，水洗，待干，镜检。2.1.3 结果 菌体呈蓝色。2.2 革兰氏染色法2.2.1 结晶紫染色液 结晶紫1 9 9 5%乙醇2 0 mL 1 0 0 草酸钱水溶液8 0 m L 将结晶紫溶解于乙 醇中，然后与草酸馁溶液混合。2.2.2 革兰氏 碘液 碘1 9 碘化钾2 9 蒸馏水3 0 0 m L 将碘与碘化钾先进行混合，加人蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶
3、解后，再加蒸馏水至3 0 0 m L o2.2.3 沙黄复染液 沙黄0.2 5 9 9 5%乙醇1 0 m L 蒸馏水一 9 0 m L中华人民共和国卫生部1 9 9 4 一 0 3-1 8 批准1 9 9 4 一 0 9 一 0 1 实施G s 4 7 8 9.2 8 一 9 4 将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。2.2.4 染色法2.2.4.1 将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1 m i n，水洗。2.2-4.2 滴加革兰氏碘液，作用1 mi n，水洗。2.2.4.3 滴加9 5 乙醇脱色，约3 0 s;或将乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再用乙 醇滴满整个涂片，脱色 1 0 s
4、o2.2-4.4 水洗，滴加复染液，复染1 m i n。水洗，待干，镜检。2.2.5 结果 革兰氏阳性菌呈紫色。革兰氏阴性菌呈红色。注 亦可用1:1 0 稀释石炭酸复红染色液作复染液，复染时间 仅需1 0。2.3 耐酸性染色法(垂一 倪二氏法)2.3.1石炭酸品红染色液 碱性品红0.3 g 9 5%乙醇1 0 m L 5%酚水溶液9 0 m L 将品红溶解于乙醇中，然后与酚溶液混合。2.3.2 3%盐酸一 乙醇 浓盐酸3 mL 9 5%乙醇9 7 mL2.3.3复染液 吕氏 碱性美蓝染色液。2.3.4染色法2.3.4.1 将涂片在火焰上加热固定，滴加石炭酸品红染色液，徐徐加热至有蒸气出现，但切
5、不可使沸腾。染液如因蒸发减少时，应随时添加。染5 m i n，倾去染液，水洗。2.3-4.2 滴加盐酸一 乙醇脱色，直至无红色脱落为止(所需时间视涂片厚薄而定，一般为1 -3 m i n)，水洗。2.3-4.3 滴加吕氏碱性美蓝染色液，复染3 0.1 m i n，水洗，待干，镜检。2.3.5 结果:耐酸性细菌呈红色，其他细菌、细胞等物质呈蓝色。2.4 柯氏染色法2.4.1 染色液2.4，1 0.5%沙黄液。2.4.1.2 0.5%孔雀绿液。2.4.2 染色法2.4.2.1 将涂片在火焰上固定，滴加。.5%沙黄液，并加热至出现气泡，约2 -3 m i n，水洗。2.4-2.2 滴加。.5%孔雀绿
6、液，复染4 0 5 0 s。水洗，待干，镜检。2.4.3 结果 布氏杆菌呈红色，其他细菌及细胞呈绿色。2.5 奥尔特氏英膜染色法2.5.1 染色液 沙黄3 9 蒸馏水1 0 0 m l,用乳钵研磨溶解。2.5.2染色法c g 4 7 8 9.2 8 一 9 4 将涂片在火焰上固定，滴加染色液，并加热至产生蒸气后，继续染3 m i n。水洗，待干，镜检。2.5.3 结果 炭疽芽胞杆菌菌体呈赤褐色，荚膜呈黄色。2.6 瑞氏染色法2.6.1 染色液 瑞氏色素0.1 g 甲醇6 0 mL 用乳钵研磨溶解。2.6.2 染色法2.6.2.1 涂片待自 然干燥后，滴加染色液，固定1 m i n,2.6.2.
7、2 加人等量蒸馏水(p H 6.5),染色3-5 m i n,2.6-2.3 用燕馏水冲洗，待干，镜检。2.7 鞭毛染色法2.了.，染色液的配制2.7.1.1 甲 液:称丹宁酸5 g,氯化高铁(F e C 1 3)1.5 g,溶于1 0 0 m L蒸馏水中，待溶解后加入1%的氢氧化钠溶液1 m L和 1 5%的甲 醛溶液 2 mL,2.7.1.2 乙液:称2 g 硝酸银溶于1 0 0 m L蒸馏水中。在9 0 m L乙液中滴加浓氢氧化按溶液，到出现沉淀后，再滴加使其变为澄清，然后用其余1 0 m L乙液小心滴加至澄清液中，至出现轻微雾状为止(此为关键性操作，应特别小心)。滴加氢氧化馁和用剩余乙
8、液回滴时，要边滴边充分摇荡，染液当夭配，当天使用，2 -3 d 基本无效。2.7.2 染色法 在风干的载玻片上滴加甲 液,4 -6 m i n 后，用蒸馏水轻轻冲净。再加乙液，缓缓加热至冒 汽，维持约半分钟(加热时注意勿使出现干燥面)。在菌体多的部位可呈深褐色到黑色，停止加热，用水冲净，干后镜检，菌体及鞭毛为深褐色到黑色。2.8 碱性复红染色法 将0.5 g 碱性复红染料溶解于2 0 m L 9 5%乙 醇中，然后用蒸馏水稀释至1 0 0 m L。如有不溶物时，可用滤纸过滤，或静置后取上清液备用。注:本染色液系用于苏云金芽胞内蛋白质毒素结晶的染色，藉以与蜡样芽胞杆菌相区别。3 生化试验培养荃和
9、试荆3.1 H u g h-L e i f s o n 培养墓(O/F 试验用)3.1.1 成分 蛋白 脉2 9 氯化钠5 9 磷酸氢二钾0.3 g 琼脂4 9 葡萄糖1 0 g 。.2 0 o 澳寮香草酚蓝溶液1 2 m L 蒸馏水1 0 0 0 m L p H7.23.1.2 制法 将蛋白陈和盐类加水溶解后，校正p H至7.2。加入葡萄糖、琼脂煮沸，溶化琼脂，然后加人指示剂。混匀后，分装试管，1 2 1高压灭菌 1 5 mi n，直立凝固备用。G s 4 7 8 9.2 8 一 9 43 门 3 试验方法 从斜面上挑取小量培养物作穿刺接种，同时接种两支培养基，其中一支于接种后滴加溶化的1%
10、琼脂液于表面，高度约1 c m，于3 6 士1 培养。3 门.4结果反应类型发酵型(F)氧化型(0)产碱型(A)封口的培养基开 口产酸不变不变的培养基产酸产酸不变3.2 铂发醉管3.2.1 成分 牛肉膏5 9 蛋白 脉1 0 g 氯化钠3 9 磷酸氢二钠(N a,H P O,1 2 H 2 0)2 g 。2%澳寮香草酚蓝溶液1 2 m L 蒸馏水1 0 0 0 m L p H7.43.2.2 制法3.2.2.1 葡萄糖发酵管按上述成分配好后，按。.5%加人葡萄糖，分装于有一个倒置小管的小试管内，1 2 1高压灭菌 1 5 mi n a3.2-2.2 其他各种糖发酵管可按上述成分配好后，分装每瓶
11、1 0 0 m L,1 2 1 高压灭菌1 5 m i n。另 将各种糖类分别配好1 0%溶液，同时高压灭菌。将5 m L糖溶液加入于 1 0 0 m L培养基内，以无菌操作分装小试管。注:蔗糖不纯，加热后会自 行水解者，应采用过滤法除菌3.2.3 试验方法:从琼脂斜面上挑取小量培养物接种，于3 6 士1培养，一般观察2-3 d。迟缓反应需观察 1 4 一3 o d o3.3 O N P G培养基3.3.1 成分 邻硝基酚R-D 一 半乳糖昔(O N P G)6 0 m g (0-N i t r o p h e n y l-(3-D-g a l a c t o p y r a n o s i
12、d e)0.O l m o l/L磷酸钠缓冲液(p H 7.5)1 0 m L 1%蛋白陈水(p H 7.5)3 0 m L13.2 制法 将 O N P G溶于缓冲液内，加人蛋白陈水，以过滤法除菌，分装于 1 0 m m X7 5m。试管，每管。.5 m l，用橡皮塞塞紧。3.3.3 试验方法 自 琼脂斜面上挑取培养物1 满环接种，于3 6 士1 培养1-3 h 和2 4 h 观察结果。如果p 一 半乳糖昔酶产生，则于 1-3 h 变黄色，如无此酶则2 4 h不变色。3.4 缓冲葡萄箱蛋白陈水(MR和V P试验用)3.4.1 成分磷酸氢二钾多陈G s 4 7 8 9.2 8 一 9 4 葡萄
13、糖5 9 蒸馏水1 0 0 0 mL p H7.03.4.2 制法 溶化后校正p H，分装试管，每管1 m L,1 2 1 高压灭菌1 5 m i n,3.4.3 甲基红(MR)试验 自琼脂斜面挑取少量培养物接种本培养基中，于3 6 士1 培养 2 -5 d，哈夫尼亚菌则应在2 2 2 5 培养。滴加甲 基红试剂一滴，立即观察结果。鲜红色为阳性，黄色为阴 性。甲 基红试剂配法:1 0 m g 甲基红溶于3 0 m L 9 5%乙醇中，然后加入2 0 m L蒸馏水。3.4.4 v-r试验 用琼脂培养物接种本培养基中，于3 6 士1 培养2-4 d。哈夫尼亚菌则应在2 2-2 5培养。加入6%a-
14、禁酚一 乙 醇溶液0.5 m L 和4 0%氢氧化钾溶液0.2 m L，充分振摇试管，观察结果。阳 性反应立刻或于数分钟内出现红色，如为阴性，应放在3 6 士1下培养4 h 再进行观察。3.5 西蔽氏柠橄酸盐培养墓3.5.1 成分 氯化钠5 9 硫酸镁(Mg S 0 4 7 H O)0.2 g 磷酸二氢钱1 9 磷酸氢二钾1 9 柠檬酸钠5 g 琼脂2 0 g 蒸馏水1 0 0 0 m L 。.2%澳身香草酚蓝溶液4 0 m L p H6.83.5.2 制法 先将盐类溶解于水内，校正p H，再加琼脂，加热溶化。然后加入指示剂，混合均匀后分装试管，1 2 1高压灭菌1 5 m i n。放成斜面。
15、3.5.3 试验方法 挑取少量琼脂培养物接种，于3 6 士1 培养4 d，每天观察结果。阳性者斜面上有菌落生长，培养基从绿色转为蓝色。3.6 克氏柠橄酸盐培并基3.6.1成分 柠檬酸钠3 9 葡萄糖0.2 9 酵母浸膏0.5 g 单盐酸半胧氨酸。.I 9 磷酸二氢钾1 9 氯化钠5 9 0.2%酚红溶液6 mL 琼脂1 5 g 蒸馏水1 0 0 0 mL3.6.2 制法 加热溶解，分装试管,1 2 1高压灭菌1 5 m i n。放成斜面。G B 4 7 8 9.2 8 一9 43.6.3 试验方法 用琼脂培养物接种整个斜面，在3 6 士1培养7 d，每天观察结果。阳性者培养基变为红色。3.7
16、丙二酸钠培养荃3.7.1 成分 酵母浸膏1 9 硫酸按2 9 磷酸氢二钾0.6 9 磷酸二氢钾。卜 4 9 氯化钠2 9 丙二酸钠3 9 0.2 Y.澳胳香草酚蓝溶液1 2 m L 蒸馏水1 0 0 0 m L p H6.83.7.2 制法 先将酵母浸膏和盐类溶解于水，校正p H后再加人指示剂，分装试管，1 2 1 高压灭菌1 5 m i n a3.7.3 试验方法 用新鲜的琼脂培养物接种，于3 6 士1 培养4 8 h,观察结果。阳性者由绿色变为蓝色。3.8 葡菊抽按培并荃3.8.1 成分 氯化钠5 9 硫酸镁(Mg S O,7 H,O)0.2 g 磷酸二氢钱1 9 磷酸氢二钾1 9 葡萄糖2 9 琼脂2 0 g 蒸馏水1 0 0 0 m L 。.2%嗅秦香草酚蓝溶液4 0 m L p H6.83.8.2 制法 先将盐类和糖溶解于水内，校正p H，再加琼脂，加热溶化，然后加入指示剂，混合均匀后分装试管，1 2 1 高压灭菌1 5 m i n，放成斜面。3.8.3 试验方法 用接种针轻轻触及培养物的表面，在盐水管内 做成极稀的悬液，肉眼观察不见混浊，以每一接种环内 含菌数在2 0 1
