1、SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T 1 1 7 1.1-2 0 0 3山羊关节炎一 脑炎抗体检测方法 酶联免疫吸附试验D e t e c t i o n o f a n t i b o d i e s a g a i n s t c a p r i n e a r t h r i t i s-e n c e p h a li t i s v i r u s-P r o t o c o l o f e n z y m e-l i n k e d i m mu n o s o r b e n t a s s a y2 0 0 3-0 3-1 7 发布2 0 0 3-0 9-0 1
2、实施中华人民共和匡国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 婿S N/T 1 1 71.1-2 0 0 3月U吕 本标准根据 O I E/c h a p t e r 2.4.4(诊断试验和疫苗标准手册 起草.本标准的附录 A、附录B均为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、国家质量监督检验检疫总局标准法规研究中心。本标准主要起草人:杨宝华、崔路、曾宪生、张艳。本标准是首次发布的检验检疫行业标准。S N/T 1 1 7 1.1-2 0 0 3山羊关节炎一 脑炎抗体检测方法 酶联免疫吸附试验范 围 本标准规定了应用酶联免疫吸
3、附试验(E L I S A)批量检测山羊血清中抗山羊关节炎一 脑炎病毒抗体的方法。本标准适用于山羊关节炎一 脑炎的流行病学调查、诊断、检疫和疫情监测。2试验原理 酶 联免 疫吸附试验(E L I S A)的基本原理是将酶分子与抗体或抗体共价结合，此种结合不改变抗体的免疫反应活性和酶的生化活性，酶标记抗体可与吸附于固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合，随后加人的底物可在酶分子的作用下呈现颜色反应，因而可借颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与样品中相应抗体或抗原的量呈正比，通过酶标仪可检测颜色反应的光密度值。本标准的反应原理就是将C A E病毒抗原包被在 9 6孔聚乙烯微量板上，接着
4、加人按一定比例稀释的待检血清，待反应一定时间后，加人酶标记的抗山羊免疫球蛋白抗体，反应完成后，加人底物显色并检测反应结果。3试验准备3.1仪器 二氧化碳培养箱、酶标仪、倒置显微镜、超速离心机、高速离心机、细胞培养瓶、多孔道微量加样器、9 6 孑 L 聚乙烯微量板等。3.2试剂3.2.1 T H E缓冲液 0.0 1 mo t/LT r i s-H C I,p H7.4,0.0 1 mo l/L氯化钠，0.0 0 1 mo l/L E D T A,3.2.2 洗涤液 含0.0 5%T w e e n-2 0的双蒸水。3.2.3 p H 7.2 P B S溶液 氯化钠 8.0 0 g,氯化钾。.2
5、 0 g,磷酸氢二钠 1.1 5 g,磷酸二氢钾。2 0 g，水溶至 1 0 0 0 m l。3.2.4 高盐稀释液 含0.0 5 0 a T w e e n-2 0,1 0%小牛血清的0.5 m o l/L 氯化钠溶液。3.3 标准抗原与血清制剂 C A E种毒、标准抗原、阳性血清、阴性血清由指定单位提供。抗山羊 I g G过氧化物酶结合物按市售说明书使用。试 验程序4.1 E L I S A操作程序4.1.1 于9 6 孔聚乙烯微量板中加人用 P B S(p H7.2)稀释的5 0 I L最适稀释度的 C AE V抗原，封 口后置4 0C 4 8 h，用洗涤液洗板二次，甩干后封口于一2 0
6、 保存备用(用前洗板四次)。IS N/T 1 1 71.1-2 0 0 34.1.2 被检血清以高盐稀释液作1，2 0 稀释.每孔加人5 0 p L，每个血清样品加二孔，每板设P B S对照二个，四个阴性对照和四个弱阳性对照，封口后于湿盒中3 7 反应2 h.4.1.3 反应结束后，甩干板内液体，洗板六次，甩干后每孔加人 5 0 p L用高盐稀释液稀释的抗山羊 I g G过氧化物酶结合物，封口后置 3 7 反应 2 卜。4.1.4 反应结束 后，连续洗板1 0 次，甩干后每孔加入1 0 0 p L 底物(用。.1 m o l/L p H 5.2 柠檬酸盐一 磷酸盐缓冲液配制的浓度为。5 m g
7、/m L的邻苯二胺，并含。1%过氧化氢)，轻拍摇匀后置暗处反应1 0 m i n-1 5 min后，每孔加人 5 0 p l.2 mo l/I硫酸终止反应。即A il 在4 9 2 n m波长下酶标仪检测光密度值(OD).5 试验结果的判定 在标准阴性血清对照反应的O D值全部小于0.1,弱阳性对照OD大于等于0.2时进行判断，O D值小于等于。.1 5时，判为阴性;O D值大于等于0.2 0 时，判为阳性;O D值在0.1 5-0.2 0之间时判为可疑，所有可疑或只有一孔呈阳性反应的样品，都必须进行重复试验，若仍出现可疑结果则判其为阳性。S N/T 1 1 7 1.1-2 0 0 3 附录A
8、 (资料性 附录)山羊滑膜细胞的制备与使用A.1 试剂 胶原酶(s i g ma 公司产品);胰蛋白酶(D i f c o产品进口分装);乙二胺四乙酸二钠(E D TA，上海试剂一厂产品);二甲基亚枫(为s i g m a 公司产品);D ME M培养粉(Gi b i c o公司产品)，应用液另加 2 5 mM/LH e p e s,1 mM/L丙酮酸钠，2 mM/L L 一 谷氨酞胺;5 0 P M/L二硫基乙醇,1 0 X 1 0 I U/L青霉素，1 0 0 mg/L 链霉素和 1 0%小牛血清,p H值调整至7.2.A.2 原代山羊滑膜细胞的制备A.2.1 放血处死初生山羊，无菌条件下
9、分离膝关节滑膜组织，用无钙、镁磷酸盐缓冲液洗涤山羊滑膜组织三次，剪成约 1 mm -2 m m 小块，放人 1 0 0 mL细胞培养方瓶内。A.2.2 加 5 倍于滑膜组织的含 1 0%小牛血清-D ME M培养液和终浓度为0.4%的胶原酶，3 7-C,5%二氧化碳培养箱内消化 Zh。A.2.3 将未粘附细胞移人离心管，3 0 0 g 离心 1 0 m i n，弃上清液，再加入同体积的0.2 5%胰蛋白酶溶液，在3 7 0C,5%二氧化碳培养箱作用 2 0 mi n-3 0 m i n.A.2.4 4 层纱布过滤，将滤液离心(3 0 0 g,1 0 mi n).A.2.5 用D ME M应用液
10、悬浮细胞，调整细胞浓度至0.5 X 1 0 c e l l s/mL，在 3 7 0C,5%二氧化碳培养箱培养 2 4 h后，弃去未贴壁细胞，置换 D ME M应用液。此时已贴壁细胞为原代滑膜细胞。A.2.6 继续培养，直至细胞长成连续单层细胞。A.3 原代山羊滑膜细胞的继代和扩大培养A.3.1 将已长成连续单层的原代山羊滑膜细胞用无钙、镁磷酸盐缓冲液洗二次后，用 0.0 5%胰蛋白酶一。.0 2 0 a E D T A消化，至细胞固缩时倾去消化液，加人含 1 0 写小牛血清的 D ME M应用液洗涤细胞，3 0 0 g 离心 1 0 mi n，将细胞再次用 D ME M的应用液悬浮，调细胞浓
11、度至。5 X 1 0 c e l l s/mL，分瓶培养。依此可连续继代扩大培养。A.4 继代山羊滑膜细胞的保存A.4.1 取已长成单层的继代山羊滑膜细胞，倾去培养液，用无钙、镁、磷酸盐缓冲液洗二遍，按 A.3.1的描述收集细胞，将离心后的细胞沉淀用含 2 0%小牛血清、1 0%二甲基亚枫的 D ME M悬液，调整细胞浓度至 5 X 1 0 c e l l s/mL,l mL分装。A.4.2 写好标贴分装好的细胞冻存管置一8 0 冰箱,2 4 h后转一1 9 6 液氮保存。A.5 继代山羊滑膜细胞的复苏和使用A.5.1 取一1 9 6 液氮保存的继代山羊滑膜细胞冻存管立即投人 3 7 0C-3
12、 9 水浴中，冻存液溶解后加人 1 0 倍体积的 D ME M应用液。A.5.2 以 3 0 0 g离心 1 0 mi n，弃上清，细胞沉淀用 D ME M应用液悬浮，调整细胞浓度至 1 X1 0 c e l l s/m l，分瓶后于3 7 0C,5%二氧 化碳培 养箱培养至 连续单层细胞，继续继代和扩大培养。A.6 制备期限 继代山羊滑膜细胞可连续继代 2 0代以上，一般在每年的产羔季节制备继代山羊滑膜细胞可满足一年的需求。S N/T 1 1 7 1.1-2 0 0 3 附录B (资料性 附录)C A E V抗原制备及E L I S A工作浓度的确定B.1病毒增殖 将 C AE V接种山羊滑
13、膜细胞进行增殖，出现合胞体后，每周收集培养液直至细胞单层完全破坏，收集的培养液置 4 保存备用。B.2 病 毒纯化和 E LI S A抗原 制备B.2.1 将收集的培养液以1 0 0 0 0 g 离心3 0 m i n eB.2.2 将上清液超滤浓缩至原体积的十分之一，再以1 0 0 0 0 g4 离心 1 6 h 沉淀病毒。B.2.3 将病毒沉淀以原培养液 1/1 0 0 0体积的T HE悬浮，再将此悬浮液在6 0 0 g离心 1 0 m i n去变性蛋白，接着将上清液加到T H E 缓冲液配制的2 5%(质量浓度)的 蔗糖垫上，在4 以4 2 0 0 0 g 离心2 h,将病毒沉淀再悬浮于
14、原培养液 1/1 0 0 0 体积的P B S中。B.2.4 用等体积的乙醚处理 P B S悬浮的病毒悬浮液，吸弃上层乙醚液，待乙醚挥发完全后，剩余的悬浮液即为 C AE V抗原，用于本试验，分装保存于一7 0 备用。B.3 C A E V抗原制备及E L I S A工作浓度的确定B.3.1 用 P B S(p H7.2)倍 比稀释抗 原(3 2 1 L/mL,1 6 I L/mL,8 p L/mL,4 p L/m L,2 p L/m L,工p L/m L)，取 96 孔聚乙烯板，每个稀释度加一列，每孔加 5 0 F a L，置湿盒内3 7 包被 2 4 h,B.3.2 用含。.0 5%T w
15、 e e n的蒸馏水连续洗板八次，甩干后加 5 0p L1:2 0高盐稀释液稀释的阳性血清和阴性血清各三排，最后两排各孔加 5 0 I L血清稀释液作空白对照，封口后于 3 7 作用 2 h,B.3.3 连续洗板 1 0 次，加兔抗羊酶标抗体(商品化)3 7 反应 2 h.B.3.4 连续洗板 1 0次，甩干后加底物 1 0 0 p i，室温下显色 1 5 mi n，加 5 0 1 L I.2 m o l/I硫酸(H2 S O 4)终止反应，4 9 2 n m酶标仪读数，计算 O D值，在空白对照各孔 O D值都小于 0.1时确认抗原工作浓度。阳性血清 O D大于等于0.2且阴性血清各孔 O D值小于0.1 时的抗原最大稀释度为工作浓度。
