1、书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准?马鼻疽检疫技术规范?发布?实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书前?言?本标准的附录?附录?附录?和附录?为规范性附录?附录?为资料性附录?本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口?本标准起草单位?中华人民共和国海南出入境检验检疫局?中华人民共和国山东出入境检验检疫局?本标准主要起草人?黄纪徽?朱来华?冯斯敏?王辉平?张薇君?云金蕊?林道颖?黄廷学?本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准?马鼻疽检疫技术规范?范围?本标准规定了马鼻疽的检疫技术规范?包括现场检疫?鼻疽菌素点眼试验?鼻疽菌素眼睑皮内注射试验?鼻疽补体结合反应?病原分
2、离与鉴定?本标准适用于进出口马?骡?驴等马属动物的马鼻疽的检疫?规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款?凡是注日期的引用文件?其随后所有的修改单?不包括勘误的内容?或修订版均不适用于本标准?然而?鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本?凡是不注日期的引用文件?其最新版本适用于本标准?食品微生物学检验?染色法?培养基和试剂?实验室?生物安全通用要求?生物安全措施试验环境和防护要求见?概述马鼻疽?是马?骡?驴感染鼻疽伯克霍尔德菌而引起的一种传染性和高致死性疾病?病原来鼻疽伯克霍尔德菌?马鼻疽常用的检验方法包括病原分离鉴定?鼻疽菌素和血清学试验?病原分
3、离鉴定方法有助于区分具有相似的临床症状的其他疾病?鼻疽菌素试验是具有敏感性和特异性的马鼻疽临床检验方法?鼻疽菌素试验有鼻疽菌素点眼法?鼻疽菌素皮下注射法?鼻疽菌素眼睑皮内注射法等方法?但常用鼻疽菌素点眼法?补体结合试验是准确和可靠的血清学试验?临床症状和病理变化参见附录?现场检疫?器材及消毒药物?器材?工作服?胶手套?线手套?防护面具?口罩?风镜?反光镜?手电筒?煮沸消毒器?脸盆?耳夹子?消毒药物?升汞水?来苏水?新洁尔灭?酒精棉球等?检查方法?检查者及助手均应穿工作服?带好乳胶手套?口罩?风镜及防护面具?选择适当位置?对保定好的马进行检查?逐项检查马的鼻腔?皮肤?颌下淋巴结及睾丸等?注意观察
4、是否有结节?溃疡?鼻漏?皮下浮肿?颌下淋巴结肿胀?睾丸炎及咳嗽?异常消瘦等症状?检查鼻腔前?先以消毒药水?如?来苏水?洗净鼻腔内外的鼻漏?然后以双手打开鼻孔?用反光镜或手电筒照射鼻腔深部?仔细检查鼻粘膜有无鼻疽特有的结节溃疡?星芒状瘢痕及其他症状?检查结束?脱掉手套?检查者及助手的手需用?升汞水或?来苏水或?新洁尔灭或?酒精棉球彻底消毒?工作服及用过的器材分别用?来苏水等浸泡?或煮沸?消毒?检疫现场用?石灰乳?热火碱水或?漂白粉水溶液消毒?判定?鼻腔鼻疽?鼻汁?发病初期在鼻孔一侧?有时两侧?流出浆液性或粘液性鼻汁?逐渐变为不洁灰黄色脓性鼻汁?内混有凝固蛋白样物质?有时混有血丝并带有臭味?呼吸带
5、哮鸣音?鼻粘膜发生结节及溃疡?在流鼻汁同时或稍迟?鼻腔粘膜尤其是鼻中膈粘膜上出现新旧大小不等灰白色或淡黄色的鼻疽结节?结节破溃构成大小不等?深浅不一?边缘隆起的溃疡?结节与溃疡多发生于鼻腔深部粘膜上?已愈者呈扁平如星芒状?冰花状的瘢痕?颌下淋巴结肿大?急性或慢性鼻疽的经过期颌下淋巴结肿胀?初有痛觉?时间长久?则变硬?触摸无痛感?附着于下颌骨内面不动?有时也呈活动性?皮肤鼻疽皮肤鼻疽多发于四肢?胸侧及下腹部?在皮肤或皮下组织发生黄豆大小或胡桃?鸡蛋大结节?不久破裂流出粘稠灰黄或红色脓汁?有时带血?形成浅圆形溃疡或向外穿孔呈喷火状溃疡?结节和溃疡附近淋巴结肿大?附近淋巴管粗硬呈念珠状索肿?肿胀周围
6、呈水肿浸润?皮肤肥厚?有时呈蜂窝织炎?橡皮腿?公畜并发睾丸炎?如临床检查发现一项或数项上述临床症状或病理变化?可以初步判定为疑似马鼻疽?按照有关规定?采集样品送实验室进一步确诊?并按?要求对有关检查人员?器具和场地进行彻底消毒?鉴别诊断在确定为鼻疽马之前?应与流行性淋巴管炎?马腺疫和类鼻疽作鉴别诊断?具体鉴别要点见附录?鼻疽菌素点眼试验?药品与器材?药品?鼻疽菌素?硼酸?来苏水?酒精?碘酒?器材?点眼器?唇?耳?夹子?煮沸消毒器?镊子?消毒盘?工作服?口罩?线手套?脱脂棉?纱布?操作方法?点眼前应两眼对照?详细检查眼结膜和单?双瞎等情况?并记录?眼结膜正常者可进行点眼?点眼后检查颌下淋巴结?体
7、表状况及有无鼻漏等?间隔?做两次点眼为一次检疫?每回点眼用鼻疽菌素原液?滴?滴?两回点眼应点于同一眼中?一般应点于左眼?左眼异常者可点于右眼?并在记录中说明?点眼应在早晨进行?最后第?的判定应在白天进行?点眼前助手固定马匹?术者左手用食指插入上眼睑窝内使瞬膜露出?用拇指拨开下眼睑构成凹兜?右手持点眼器保持水平方向?手掌下缘支撑额骨眶部?点眼器尖端距凹兜约?拇指按住点眼器胶皮乳头滴入鼻疽菌素?滴?滴?点眼器在所盛鼻疽菌素用完或在点眼过程中被污染?接触结膜异物?时?应消毒后再使用?点眼后防止风沙侵入?阳光直射眼睛及动物自行摩擦眼部?结果的观察?应在点眼后?各检查一次?共检查三次?判定时先由马头正面
8、对照观察两眼?在第?要翻眼检查?其余观察必要时翻眼?细查结膜状况?有无眼眵?并按判定符号记录结果?每次检查点眼反应时均应记录判定结果?最后判定以两次点眼中最强一次反应为准?鼻疽菌素点眼反应判定标准?阴性反应?点眼后无反应或结膜轻微充血或流泪?为阴性?记录为?疑似反应?结膜潮红?轻微肿胀?有灰白色浆液性或粘液性?非脓性?分泌物?眼眵?的?为疑似阳性?记录为?阳性反应?结膜发炎?肿胀明显?有数量不等脓性分泌物?眼眵?的为阳性?记录为?鼻疽菌素眼睑皮内注射试验?药品及器材?鼻疽菌素?用前随时稀释?鼻疽菌素?份用?石炭酸稀释液?份充分混匀?注射器?针头?用前煮沸消毒?消毒盘?煮沸消毒器?镊子?耳夹子?
9、工作服?口罩?线手套?石炭酸稀释液?酒精?碘酒?硼酸?来苏水?纱布?灭菌脱脂棉?操作?注射前检查结膜及眼晴是否单?双瞎等情况?注射后检查颌下淋巴结及有无鼻漏?并详细记录检查情况?注射部位通常在左下眼睑边缘?内侧眼角三分之一处皮肤实质内?注射前用硼酸棉消毒注射部位?注射前助手保定马匹?术者用左手食指?拇指捏住下眼睑?右手持注射器?在下眼睑皮内注入?鼻疽菌素?食指感觉注射液推进迟滞?局部呈现小包?即为药液已进入皮内?注射一般在早晨?注射后第?分别进行检查?详细记录结果?鼻疽菌素眼睑皮内注射反应判定标准?阴性反应?无反应或下眼睑有极轻微肿胀?流泪的?为阴性反应?记录为?疑似反应?下眼睑稍肿胀?有轻微
10、疼痛及发热?结膜潮红?无分泌物或仅有浆粘液性分泌物的?为疑似阳性?记录为?阳性反应?下眼睑肿胀明显?有显著的疼痛及灼热?结膜发炎畏光?有脓性分泌物的?为阳性?记录为?补体结合试验?材料准备?被检血清?见附录?绵羊红细胞?见附录?补体?冻干品?马鼻疽阴性血清?阳性血清?马鼻疽补体结合抗原?溶血素?冻干品?使用前用蒸馏水溶解至规定容积?稀释液?巴比妥缓冲液?见第?章?酶标仪?预备试验?溶血素?补体?抗原等效价测定?溶血素效价测定?通常一个月左右测定一次?稀释溶血素?先将溶血素稀释成?的基础液?如溶血素以石炭酸防腐时?取?加?稀释液?如以甘油为保存液?则取?加?稀释液?混合均匀?再按表?进一步稀释?
11、表?溶血素稀释法要?素稀?释?倍?数?溶血素?稀释液?全量?溶血素效价测定的方法?按表?表?溶血素效价测定法?总体积?要?素稀?释?倍?数对?照?溶血素补体红细胞稀释的溶血素?稀释液?补体?红细胞悬液?温?育?水浴?按表?操作结束后?取出微量反应板?对照不出现溶血现象?微量反应板轻微振动混匀后?读取?值?与标准比色孔?见附录?比较?观察溶血度?记录结果?溶血素效价确定?能使?的?红细胞悬液在?水浴箱内?出现完全溶血?的最小溶血素量?称为一个溶血素单位?或溶血素效价?测定补体?抗原和做正式试验时?溶血素的用量为?个溶血素单位或称工作量?制备致敏红细胞悬液?按测定的溶血素效价稀释溶血素至?个标准单
12、位?缓慢加入到等量的?绵羊红细胞悬浮液中?混合均匀?置?水浴箱中温育?即制备成致敏红细胞悬液?补体效价测定每次进行补体结合反应试验?应于当日测定补体效价?先用稀释液?将补体做?稀释?然后按表?进行操作?表?补体效价测定?总体积?要?素孔?号对照?补体?稀释液?补加稀释液?温?育?水浴?致敏红细胞?温?育?水浴?按表?操作结束后?取出微量反应板?对照不出现溶血现象?微量反应板轻微振动混匀后?读取?值?与标准比色孔?见附录?比较?确定出现?溶血时补体的最高稀释倍数为补体的效价?即该浓度为此反应体系下?个补体溶血单位?正式试验补体工作浓度为?个?抗原效价的测定按表?进行抗原效价的测定?表?抗原效价测
13、定?总体积?要?素抗原稀释倍数对照?稀释的抗原?稀释的阳性血清?表?续?要?素抗原稀释倍数对照?水浴?补体?稀释液?温?育?水浴?致敏红细胞?温?育?水浴?注?每一血清稀释度?各做一行?共计?行?按表?操作结束后?取出微量反应板?对照不出现溶血现象?微量反应板轻微振动混匀后?读取?值?与标准比色孔?见附录?比较?观察溶血度?记录结果?抗原效价的确定?在对照成立时?与阳性血清各稀释度发生抑制溶血最强的抗原最高稀释度为抗原效价?即为?个单位抗原?正式试验抗原使用?个单位?即为该抗原的工作浓度?正式试验?要素准备按?的测定结果对各要素作稀释?被检血清?见附录?工作抗原?按测定的效价稀释成工作浓度?单
14、位抗原?用?工作补体?按测定的效价稀释后工作浓度?用?致敏红细胞悬液?见?每孔加?鼻疽阳性血清?灭活后?稀释?用?鼻疽阴性血清?灭活后?稀释?用?血清效价测定按表?的程序实施血清效价测定?表?血清效价测定?总体积?要?素稀?释?倍?数血清试验孔血清抗补体对照?抗原对照补体对照?红细胞对照血清?单位抗原?稀释液?水浴?补体?温?育?水浴?致敏红细胞?温?育?水浴?结果判定条件按表?操作结束后?取出微量反应板?轻微振动混匀后?读取?值?比照标准比色孔?附录?判读?各对照的结果如下时?可判定被检血清孔?否则?补体的效价应重新测定?并重做?的正式试验?个单位补体对照?溶血?个单位补体对照?溶血?个单位
15、补体对照?不溶血?抗原对照?溶血?红细胞对照?不溶血?阴性血清对照?完全溶血?阳性血清对照?完全不溶血?血清抗补体对照?抗补体对照孔应为?溶血?如果抗补体对照孔与试验孔的抑制溶血程度相同说明该血清为抗补体?血清抗补体可重新采样或用其他方法检测?结果判定被检血清?稀释?抑制溶血大于等于?判为阳性?抑制溶血在?之间判为可疑?溶血程度在?溶血判为阴性?达到?抑制溶血或以上时血清的最高稀释度为该血清的效价?病原分离与鉴定?设备和器材设备和器材如下?温箱?显微镜?无菌棉拭子?载玻片?灭菌平皿?灭菌试管和试管架?酒精灯?培养基和试剂?甘油肉汤?见附录?孔雀绿酸性复红甘油琼脂?见附录?硫堇葡萄糖甘油琼脂?见
16、附录?生化用培养基?按?中第?章的规定?革兰氏染液?按?中?的规定?样品的采集与处理?患病活动物?用棉拭子采集鼻腔分泌物?皮肤溃疡物或脓肿穿刺物?直接接种在孔雀绿酸性复红甘油琼脂或硫堇葡萄糖甘油琼脂平板上?或将其置于每毫升含青霉素?的稀释液试管中待检?死亡的动物?可解剖后无菌采集有病变的肝?肺等内脏器官?病原分离?采取的样品?可以直接接种在孔雀绿酸性复红甘油琼脂或硫堇葡萄糖甘油琼脂平板上?培养?也可以将样品置于甘油肉汤中?增菌培养?后?再接种在孔雀绿酸性复红甘油琼脂或硫堇葡萄糖甘油琼脂平板上?在孔雀绿酸性复红甘油琼脂平板上培养?后?鼻疽伯克霍尔德菌形成淡绿色菌落?在硫堇葡萄糖甘油琼脂平板上培养?后?形成淡黄绿色到灰黄色菌落?挑取可疑菌落做纯培养?然后用平板凝集试验和生化试验进行鉴定?鼻疽伯克霍尔德菌的鉴定?革兰氏染色镜检?鼻疽伯克霍尔德菌为革兰氏阴性?无芽胞?无荚膜?不运动?单在?成对或成群的中等大小杆菌?但老龄培养菌常呈多形性?有棒状?分枝状和长丝状?平板凝集反应?用鼻疽伯克霍尔德菌阳性血清做平板凝集反应?应呈阳性反应?生化试验?分别接种各类生化反应培养基?具体的生化反应内容见表?表
