1、书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准?国境口岸产气荚膜梭菌毒素检测方法?发布?实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书前言本标准按照 给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国珠海出入境检验检疫局。本标准主要起草人：相大鹏、师永霞、林继灿、李小波、陈永红、洪烨、黄吉城、郑夔、幸芦琴、郭波旋、钟玉清。犛 犖犜 国境口岸产气荚膜梭菌毒素检测方法范围本标准规定了产气荚膜梭菌食物中毒样品的采集和运送、产气荚膜梭菌的分离培养、产气荚膜梭菌肠毒素的检测、产气荚膜梭菌、和肠毒素基因的 检测及多重 检测以
2、及生物安全要求。本标准适用于国境口岸入出境人员以及国境口岸食品生产经营和服务单位从业人员的产气荚膜梭菌食物中毒，同时也适用于国境口岸范围的水、食物、食物中毒样品的产气荚膜梭菌毒素检测。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。食品卫生微生物学检验产气荚膜梭菌检验 食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂 出口食品中产气荚膜梭状芽孢杆菌检验方法产气荚膜梭菌食物中毒诊断标准及处理原则术语和定义下列术语和定义适用于本文件。产气荚膜梭菌犆 犾 狅 狊 狋 狉 犻 犱 犻 狌
3、犿狆 犲 狉 犳 狉 犻 狀 犵 犲 狀 狊是一种革兰氏阳性、产生芽孢、严格厌氧及形成特殊荚膜的梭状杆菌。广泛分布于自然界的水源、土壤中及存在于人和动物肠道中，可以引起人和动物坏死性肠炎、肠毒血症以及人畜创伤性气性坏疽，特别是引起严重的食物中毒。产气荚膜梭菌毒素犆 犾 狅 狊 狋 狉 犻 犱 犻 狌 犿狆 犲 狉 犳 狉 犻 狀 犵 犲 狀 狊狋 狅 狓 犻 狀 狊产气荚膜梭菌主要产生、外毒素和肠毒素 。根据该菌产生致死性、外毒素的能力不同，可以分为共种菌型，其中对人致病的主要是型（产生毒素，部分菌株还产生肠毒素 ），也有少数为型（产生毒素和毒素），主要引起人的食物中毒和坏死性肠炎，甚至可以引
4、起肠毒血症，造成人的死亡。试剂和材料 主要仪器 扩增仪。天平。超净工作台。犛 犖犜 高压灭菌锅。低温高速离心机：最大离心力 犵。电泳仪。凝胶成像分析系统。旋涡振荡器。冰箱：和。移液器：、和。恒温水浴锅。恒温培养箱：。厌氧培养装置。主要试剂 除另有规定外，所有试剂均采用分析纯。犜 犪 狇 聚合酶）。产气荚膜梭菌肠毒素 检测试剂盒（美国 公司）。其他试剂参见附录。生物安全要求 样品的病原菌分离纯化、生化鉴定、涂片、显微观察、免疫学实验、扩增模板制备等含有致病性活菌的初步检测活动需在生物安全二级实验室（）进行。家兔肠袢试验需在动物生物安全二级实验室（）进行。不含致病性活菌材料的 操作和免疫学等实验需
5、在生物安全一级实验室（）进行。样品的采集和运送 样品的采集 患者粪便标本的采集用灭菌竹签或吸管等工具采取腹泻患者粪便，置于灭菌试管或盛有生理盐水的试管中。采不到粪便的人员可用肛拭采取。可疑食物标本的采集一般采用灭菌食品夹子或铲子等工具采取剩余食物，采取的标本可置于灭菌容器中。固体食物 ；液体食物 。饮料、饮用水等液体样品，定性包装的可整体采取，散装的可置于罐（瓶）中。食品加工用具、容器表面涂抹物等标本的采集饮食用锅、刀、抹布、砧板、盛放器具等加工用具可用粘取少量灭菌生理盐水的灭菌棉拭涂抹容器内壁，其他用具可涂抹与食品接触的表面，涂抹完毕将棉拭置于装有生理盐水的试管中。）、）由指定单位提供，给出
6、这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。犛 犖犜 样品的运送采集的样品应在冷藏条件下，内送达实验室检测；无冷藏条件的，于采样后内送达实验室。产气荚膜梭菌的分离培养具体方法见 和 。产气荚膜梭菌肠毒素的检测 肠毒素的提取由粪便提取肠毒素时，用生理盐水将粪便制成 倍稀释乳悬液，充分搅拌，室温放置 ，犵离心 ，吸取上清液进行检测试验。分离的菌株经庖肉培养基（）培养 作为原始菌种。按（体积分数）接种原始菌种于液体硫乙醇酸钠培养基（），热处理 以促进芽孢的形成，冷却后 培养（若此培养芽孢形成不多，上述处理及培养可反复次次），然后仍按
7、（体积分数）转种于 培养基，培养，作为产毒种子，按 （体积分数）接种于产芽孢培养基（），保温 ，立即转换 培养 ，培养液经 犵离心 ，吸取上清液进行检测试验。肠毒素的检测 家兔肠袢试验（标准方法）准备体重约 的健康家兔，术前断食天（只给饮水），在麻醉下剖腹取出回肠段，在盲肠以上 处开始结扎，每个肠袢长 ，每两个试验袢之间有一个间隔袢，间隔袢长 ，至多段，分别注入检样液、阴性对照液（生理盐水）、阳性对照液（产气荚膜梭菌肠毒素或产肠毒素的产气荚膜梭菌标准菌株的 培养上清液）及中和对照（检样液与产气荚膜梭菌肠毒素免疫血清混合，室温放置 ）各（中和对照液可增加血清所占容量），以生理盐水润湿肠子表面，将
8、肠袢送回腹腔，缝合。后开腹测量各段肠袢的长度犔（）与肠袢中积液的体积犞（）。检样及阳性对照肠段的内液量与长度之比值（犞犔）大于或等于，而阴性对照及中和对照小于 或肉眼观察不到明显反应时，判为阳性结果。反向间接血球凝集试验（辅助方法）上清液于微孔板型孔内以树胶缓冲液或蛋白缓冲液进行系列稀释，各孔稀释液，加以相同缓冲液稀释的致敏血球。以检样加非致敏血球为阴性对照，以精制产气荚膜梭菌肠毒素加致敏血球为阳性对照。充分摇和后室温静放，出现明显凝集者判为阳性结果。若阴性对照孔出现凝集，检样可加等量的 非致敏血球，充分摇和，室温放置 ，犵离心 ，取上清液按前述方法进行试验。琼脂双扩散试验生理盐水配制的琼脂糖
9、，溶化后取 浇注于 载玻片上。凝固后打孔，孔径，中心孔与周围各孔间隔。中心孔加入适当稀释的抗血清，周围孔加用 稀释的不同稀释度的检样，加样后，将琼脂板放入湿盒，置 ，观察结果。在检样孔与适当稀释度的抗血清孔间有白色的沉淀线出现者判为阳性结果。犛 犖犜 粪便标本肠毒素的酶联免疫试验（犈 犔 犐 犛 犃）可选用商品化试剂盒进行操作，以下为按照美国 公司试剂盒的操作步骤：）检测前将试剂盒中的所有成分平衡至室温；）样品稀释：将 的液体粪便标本加至 的样品稀释液中，涡旋，置于冰箱待用。加样到微孔板之前再涡旋混匀；）至少准备个微孔：孔为样品孔、孔为阴性质控、孔为阳性质控。在每孔内加入 结合物；）在样品孔中
10、加入 稀释的粪便样品，分别在阳性孔和阴性孔中加入 质控。用试剂盒内的盖板盖好。孵育；）孵育后，移去盖板，甩干孵育液，使用 洗液洗涤所有的微孔次。每次浸泡至少。最后将微孔板置于纸巾上，小心轻敲使孔中不再含液体；）分别在所有微孔中加入 底物液。室温下暗处孵育 ；）分别在所有孔中加入 终止液，孵育产生的蓝色变成黄色；）加入终止液 后，在 内读取 处吸光度值（）；）为了确认实验有效，结果应符合如下标准：阴性质控：或 、；阳性质控：或 或 ；）结果判断如下：或 或 的样本为阳性；或 或 的样本为阴性。产气荚膜梭菌、和肠毒素基因的犘 犆 犚检测及多重犘 犆 犚检测 犘 犆 犚扩增模板的制备挑取产气荚膜梭菌
11、单菌落至 的无菌水中，涡旋混匀，沸水浴作用 ，经 犵离心后取 上清液作为 扩增的模板。犘 犆 犚扩增 毒素基因的犘 犆 犚引物毒 素 基 因 的 扩 增 引 物：和 ，预计扩增片断大小为 ；毒素基因的 扩增引物：和 ，预计扩增片断大小为 ；肠毒素基因的 扩增引物：和 ，预计扩增片断大小为 。犘 犆 犚扩增体系取 管编号，反应体积为，具体反应体系见表。检测过程设立阴性对照、阳性对照和空白对照，用型（含肠毒素）和型产气荚膜梭菌标准菌株的裂解液上清液作阳性对照模板，用非产气荚膜梭菌的细菌作阴性对照，用水作空白对照模板。反应程序为：；然后 、，个循环；最后 延伸 。犛 犖犜 表犘 犆 犚反应体系试剂名
12、称储备液浓度加入反应体系的体积 缓冲液（），氯化镁，氯化钾，（）毒素基因引物 上、下游引物各毒素基因引物 上、下游引物各肠毒素基因引物 上、下游引物各多重 引物 毒素基因上、下游引物各毒素基因上、下游引物各肠毒素基因上、下游引物各犜 犪 狇酶 模板 （单基因 ）或 （多重 ）注：反应体系中各试剂的量根据反应体系的总体积进行适当调整。犘 犆 犚扩增产物电泳检测取 琼脂糖，加入 电泳缓冲液加热溶解，加入溴化乙锭至终浓度 ，制胶，取 的 扩增产物与适量的 上样缓冲液混合，点样，同时加入 ，恒压，电泳 左右，用凝胶成像系统照相记录结果。结果判断 质量控制反应结果应同时符合以下个条件，否则实验结果无效：
13、）阴性对照和空白对照未出现特异性条带；）型产气荚膜梭菌阳性对照出现 的毒素和 的肠毒素扩增带；）型产气荚膜梭菌阳性对照出现 的毒素和 的毒素扩增带。结果分析在实验结果有效情况下，如待测样品出现预期大小的扩增条带，则可初步判断产气荚膜梭菌中含有对应的毒素基因，初步判断为阳性结果的样品可通过复检和核酸序列测定进行确认。如待测样品中未出现预期大小的扩增产物，则可判断产气荚膜梭菌中不含有对应的毒素基因。测序（可选择）将 扩增产物进行序列测定，确定其碱基组成并与已经发表的毒素基因的序列进行比对，判断产气荚膜梭菌中是否含有、或肠毒素基因。犛 犖犜 附录犃（资料性附录）试剂的配制犃 电泳缓冲液（）：称取 碱，溶于 的 中，加入 （），冰乙酸，至充分溶解后用水定容至，室温储存。犃 树胶缓冲液：磷酸盐缓冲盐水（）含吐温 、阿拉伯胶 。犃 蛋白缓冲液：磷酸盐缓冲盐水（）含牛血清蛋白 。犃 庖肉培养基（）和液体硫乙醇酸钠培养基（）：制法见 。犃 芽孢培养基（）：制法见。犛 犖犜
