1、主讲：刘晨光 孜力汗Tel：13700088096Email:cg_,生物技术专业实验,教师信息,教授课程：大学生就业指导 生物反应工程(双语)海洋微生物学 生物工程（技术）专业实验,教育经历：2001.9 2011.5 大连理工大学，生物工程，本硕博2009.5 2010.9 University of Saskatchewan(Canada)，生物化工，博士生工作经历：2004.9 2008.7大连理工大学，04级本科生辅导员2011.9 2013.9大连理工大学，师资博士后2013.9 今 大连理工大学，讲师,助教信息,李益民,郝学密,课程内容,理论讲解（2学时）自酿红葡萄酒（4学时）生
2、物碱分离提取（8学时）酒精发酵工艺试验（16学时）基因工程重组蛋白的表达与分离纯化（18学时）,实验考核标准,实验分组,实验一 红葡萄酒酿制工艺实验,葡萄酒有很多好处，但是吃葡萄却达不到喝葡萄酒的保健效果，这是因为红葡萄里抗衰老的自由基主要存在于葡萄皮里，而防治心血管病有效的丹宁酸，主要在葡萄籽中。所以长期适量的正确饮用红葡萄酒，确实可以起到养身保健作用。,背景知识,红葡萄原料破碎后，皮渣和葡萄汁混合发酵，将葡萄糖转化为酒精的过程。同时葡萄果粒中的有机酸、维生素、微量元素及单宁、色素等多酚类化合物，浸取转移到葡萄原酒中。红葡萄原酒经过贮藏、澄清和稳定处理，即成为精美的红葡萄酒。,实验原理,主要
3、工艺流程,葡萄去坏、除梗、破碎,主发酵（前发酵、酒精发酵，不需密封）,分离残渣与酒液,装密封容器陈酿发酵（后发酵、苹-乳酸发酵，隔绝空气）,澄清或过滤,装瓶饮用,实验材料,葡萄 制作葡萄酒的关键，7分葡萄3分酿造。受生长气温、降雨量、土壤等气候条件决定。酿红葡萄酒的葡萄品种有赤霞珠、品丽珠、美乐、西拉、黑比诺等，最好不用食用葡萄酿酒。红葡萄酒的颜色来源于葡萄皮肉所含色素，所以必须选用颜色深（紫黑），成熟度高的新鲜、干净的红葡萄。葡萄酒酵母 耐受高温、酒精的能力强，在自然发酵的过程中得以大量繁殖，并能顺利地完成酒精发酵过程。,实验步骤,一、第一阶段(主发酵)要准备的工具和容器：食品级带旋盖的PV
4、C塑料桶几个，灭菌纱布等（各组准备）葡萄的分选：选择完全成熟的新鲜葡萄除烂、去梗、破碎，尽快放入准备好的容器中不要超过容器总容量的2/3。每组5斤（包括品尝和实验）加蔗糖每天搅拌两到三次，这时盖子不用盖太紧。看到发酵结束的迹象（气泡减少或消失，皮渣有沉淀，桶温与环境温度差值减小或残糖达到5g/L以下）就开始考虑倒桶以防酒体“还原”。此阶段最好控制在7天内完成。,加糖,越少加越好，葡萄的甜度够就不加（达到制作12度葡萄酒的浓度值230克/升），否则就要补齐糖度。从理论上讲，加入17g/L蔗糖可以提高1度酒。最终葡萄酒口味以含糖量小于4g/L风味良好。通过比重计测量糖度值后查表得出，然后再套用如下
5、公式：加糖量克数=葡萄汁升数（希望得到的成酒度数根据测出的葡萄汁比重查表得到相应的成酒的度数）18（或17或19）注：17克是用去皮渣的汁液来计算的，18克是按带皮渣的来计算的，19克是根据保证酒精度这个要求以及实践教训（1.16的教训系数，弥补在发酵过程中糖的损失171.16=19.72）作出的。,二、第二阶段（陈酿发酵）将酒体和皮渣用导管抽出（纱布过滤）倒入准备好的第二阶段容器中，大约100斤葡萄出25升酒左右。第一阶段属半开放式发酵，第二阶段要严格单向密封。因为第二阶段的苹乳酸发酵也会有CO2析出，同时又不希望葡萄酒被氧化，所以需要单向密封，让气体只出不进。苹-乳酸自然发酵条件为：PH3
6、.2以上，酒精度12度以下，温度22-25度之间，还有一个重要因素就是所用葡萄存在活性乳酸菌种。以上条件只要有一个不满足发酵就不会进行。因此成功与否是不确定的。,实验步骤,实验步骤,三、贮藏 葡萄酒的贮藏要求全密封容器，储藏酒时要将酒加满罐、避光，温度控制在10-20度无异味的房间内。,苹乳酸发酵,苹果酸是双羧基酸，口味比较尖酸。红葡萄酒的后发酵过程，也叫苹果酸乳酸发酵过程。这个过程是在乳酸细菌的作用下，将苹果酸分解成乳酸和CO2的过程。经过苹果酸乳酸发酵的红葡萄酒，尖酸降低，果香醇香加浓，口感柔协肥硕，才称得上名副其实的红葡萄酒。,实验创新,1、自制各种风味酸奶：通过查阅文献，采用不同菌种及
7、发酵工艺制作不同；2、自制天然饮料：通过查阅文献，针对目前办公室人群制作方便饮用的天然营养饮料，如袋泡天然果汁等。3、自制各种果酒：通过查阅文献，采用不同原料、发酵工艺和方法进行不同果酒的制作；,思考题,为什么不能将葡萄洗的太干净？前酵过程中为什么进行适当的搅拌？请描述一下自己酿造的红葡萄酒的味道？,实验二 黄柏中小檗碱的提取和鉴定,黄柏为芸香科植物黄皮树(Phellodendron Chinese Schneid.)及黄柏(Phellodendron amurense Rupr.)除去栓皮的干燥树皮。味苦、性寒。能清热燥湿，泻火解毒，退虚热。其主要成分为小檗碱(berberine)，含量约1
8、.4%-4%（黄皮树根中含量较高）。,背景知识,小檗碱：属生物碱，缓溶于水，冷乙醇溶解度不大，但易溶于热水或热乙醇，难溶有机溶剂。小檗碱主要以盐酸盐形式存在。在冷水中溶解度小，较易溶于沸水。提取和分离过程中沉淀反应和显色反应可用于生物碱的检测和鉴定。,实验原理,提取盐酸小檗碱常用的方法,酸水法石灰乳法（可操作性强）醇提法超声提取法,实验原理,柱色谱：湿法装柱。吸附剂（固定相）为中性氧化铝。洗脱剂（流动相）为95%乙醇，收集鲜黄色带。硅胶薄层色谱：利用硅胶的吸附作用，生物碱极性小，Rf值小；极性大，Rf值小。展开剂是关键。不能与分离物质发生反应；若Rf值小，可在氯仿中加入甲醇等极性大的溶剂。,色
9、谱分析,色谱分析,比移值（Rf值）在薄层色谱中，组分的迁移距离(a)与展开剂的迁移距离(b)之比称为比移值(Rf)。Rf=硅胶板属于正相色谱，展开剂极性越大，洗脱能力越强，比移值就越大。调整展开剂极性，良好的分离，Rf值应在0.150.75之间。,a,b,溶剂前沿,展开后斑点,起始线,色谱分析,渗漉：黄柏皮粗粉50g,加水溶胀,（水量至少超过黄柏粉），记录总体积。然后在研钵中研磨少量Ca（OH）2，质量为终体积1%。搅拌均匀，浸渍2小时以上或过夜。盐析：收集渗漉液，加入渗漉液总体积20%（W/V）的食盐，搅拌后放置，抽滤。精制：沉淀溶于20倍量沸水中，趁热过滤。滤液加浓盐酸调至pH 2-3，放
10、置，过滤。80烘干即得盐酸小檗碱精制品。柱色谱：70g中性氧化铝，加入95%乙醇调成浆状，湿法装柱，不能有气泡和裂缝。样品的乙醇体积要少，收集鲜黄色带。薄层色谱鉴定：展开剂中氯仿和甲醇的比例。,实验流程,注意事项,黄柏中富含粘液质,石灰乳能使其变性沉淀,1%的Ca(OH)2浓度较适宜。20%NaCl 溶液盐析产率较高。一定用浓盐酸调节pH值。分离柱液面尽量水平。展开剂中氯仿和甲醇的比例由Rf值确定，对初始的 9：1比例适当调整,实验创新,查阅文献，可采用不同分离方法：石灰乳法可分别使用NaOH、Ca(OH)2、CaO粉末；醇提法超声提取法酸水法运用薄层色谱进行鉴定，可采用不同的展开剂及配比进行
11、样品分离，通过调整展开剂极性，实现样品的良好分离，观察并比较展开效果，计算比移值。简述展开效果不同的理由；,思考题,简述从黄柏皮中提取小檗碱是利用了它自身的什么性质实现的；简述石灰乳法提取小檗碱时，加入CaO粉末的目的；阐述提取分离过程中加NaCl起什么作用；,实验三乙醇发酵工艺综合试验,背景知识,应用现状,美国的燃料乙醇生产量占世界总量的一半以上。,巴西的汽油中必需含有20%-25%的乙醇。现在含量平均为23%。,中国黑、吉、辽、皖、豫五省使用混合10%乙醇的汽油,生产前三名,生物乙醇,工艺流程,淀粉类物质在液化酶和糖化酶等双酶或多酶作用下，水解成还原性单糖物质。酵母菌在厌氧条件下可发酵己糖
12、形成乙醇，其生化过程主要是:第一阶段己糖通过糖酵解途径(EMP途径)分解成丙酮酸。第二阶段丙酮酸由脱羧酶催化生成乙醛和二氧化碳，乙醛进一步被还原成乙醇。葡萄糖发酵成乙醇的总反应式为：C6H12O62C2H5OH+2CO2+能量,实验原理,淀粉质原料是生产酒精的主要原料。我国发酵酒精的80%是用淀粉质原料生产的，其中薯类原料约占45%，玉米等谷物原料约占35%。本实验是以玉米粉为原料生产发酵用单糖。淀粉是多糖中最易分解的一种，由许多葡萄糖基团聚合而成。天然淀粉具有直链淀粉和支链淀粉两种结构，它们在性质和结构上有差异。在大多数植物淀粉中，直链淀粉含量为2030。,1.双酶法制备糖化醪,直链淀粉是-
13、D葡萄糖通过1，4糖苷键连接而成的聚合物，分子量32400162000。溶解于7080的温水,遇碘呈深蓝色。支链淀粉是D葡萄糖通过1，4糖苷键及1，6糖苷键（在分支点上）连接而成的聚合物。其分子量较直链淀粉的大，可达107。支链淀粉不溶解于温水,遇碘呈蓝紫。,1.双酶法制备糖化醪,淀粉的糊化,淀粉糊化指淀粉受热后，淀粉颗粒膨胀、晶体结构消失、互相接触变成糊状液体，即使停止搅拌，淀粉也不会再沉淀的现象。经糊化的淀粉称为-淀粉。糊化目的：打破淀粉颗粒的晶体结构，使淀粉酶能直接作用于淀粉。,1.双酶法制备糖化醪,-淀粉酶能从分子内部切开-1，4糖苷键，但不能水解-1，6糖苷键及其附近几个-1，4糖苷
14、键。当-淀粉酶作用于淀粉糊时，能使其黏度迅速下降，故又称液化酶，此过程也称为淀粉的液化。直链淀粉经该酶水解的最终产物为葡萄糖和麦芽糖。支链淀粉的水解产物除葡萄糖、麦芽糖外，还有具有-1，6键的极限糊精和含有4个或更多葡萄糖残基的带键的低聚糖。,淀粉的液化,1.双酶法制备糖化醪,葡萄糖淀粉酶能从淀粉的非还原末端逐个切下葡萄糖，它既能水解-1，6糖苷键，又能水解-1，4糖苷键。由于形成的产物几乎都是葡萄糖，因此该酶又称为糖化酶。,淀粉的糖化,1.双酶法制备糖化醪,糊化：玉米粉：水=1：3.5，pH值5.56.0（总体积2000ml）注意：随时搅拌，补水，记录粘度最大时温度液化：-淀粉酶(1ml/k
15、g粉)，9597，1.5小时，随时补水 糖化：58-60,pH值4.44.6，加入糖化酶（1.2ml/kg粉），60糖化10小时以上过滤：补足水分，4层纱布过滤，调节滤液pH在5.0左右灭菌：2000ml糖化醪液装罐，灭菌。,1.双酶法制备糖化醪,空白滴定：斐林甲、乙液各5ml和水20ml，5ml水做空白样品。250ml三角瓶中，用0.1%标准葡萄糖溶液滴定，所耗标准葡萄糖溶液毫升数记为V空。试样滴定：5ml发酵液代替空白，记下所用标准葡萄糖溶液毫升数为V实。*若残糖很高，滴定不出，将试样稀释后再滴定*沸腾状态下，3分钟内滴完，每次滴定均重复3次以上 还原糖（g/ml）=,糖化醪总糖,2.费林滴定法,实际生产中用于酒精发酵的几乎全是酒精酵母，俗称酒母。本实验所用的酵母是白凤武教授课题组研发的自絮凝酿酒酵母。酵母生长培养基的配制：葡萄糖3%，酵母粉0.4%，蛋白胨0.3%。每个250ml培养瓶中含100ml培养基,每组至少配制6瓶,28-30下摇床震荡培养24小时,肉眼可见酵母颗粒。每瓶培养基倒出，剩余的酵母倒入灭菌的糖化醪液中，瓶口封8层纱布盖塑料布（用针扎小眼），28-30下发酵48小时以上。,3.酵母细胞培养及接种,
