1、第九章第九章 转基因动物技术转基因动物技术及其应用及其应用 一、转基因动物概述一、转基因动物概述 转基因动物转基因动物(Transgenic Animal)(Transgenic Animal)是指通过实是指通过实验方法，人工地把人们想要研究的动物基因或人类验方法，人工地把人们想要研究的动物基因或人类基因，或者是有经济价值的药物蛋白基因等基因，或者是有经济价值的药物蛋白基因等通称通称为外源基因为外源基因导入动物的受精卵导入动物的受精卵或早期胚胎细或早期胚胎细胞胞，使之与动物本身的基因组整合在一起，这样，使之与动物本身的基因组整合在一起，这样外源基因能随细胞的分裂而增殖，并能稳定地遗传外源基因能
2、随细胞的分裂而增殖，并能稳定地遗传给下一代的一类动物。给下一代的一类动物。曾溢滔院士曾溢滔院士 转基因动物是指用实验导入的方法将外源基因转基因动物是指用实验导入的方法将外源基因在染色体基因组内稳定整合并能稳定表达和遗传的在染色体基因组内稳定整合并能稳定表达和遗传的一类动物一类动物包括基因敲除的动物包括基因敲除的动物。遗传性动物基因工程遗传性动物基因工程：外源基因能够通过配：外源基因能够通过配子进行垂直传递并稳定遗传。子进行垂直传递并稳定遗传。非遗传性动物基因工程非遗传性动物基因工程：转基因仅在当代表：转基因仅在当代表现，不能遗传给子代。现，不能遗传给子代。一、转基因动物概述一、转基因动物概述
3、1 1第一例显微注射法产生转基因小鼠第一例显微注射法产生转基因小鼠 19801980年，年，GordonGordon等把等把SV40 DNASV40 DNA显微注射到小鼠受精卵中，显微注射到小鼠受精卵中，获得了两只转基因小鼠，创立了显微注射转基因方法。获得了两只转基因小鼠，创立了显微注射转基因方法。3 3转基因家畜的产生转基因家畜的产生 转基因家兔、绵羊和猪转基因家兔、绵羊和猪(Hammer(Hammer等，等，1985)1985)、牛、牛(Bondioli(Bondioli等，等，1988)1988)和山羊和山羊(Ebert(Ebert等，等，1991)1991)等相继出世。等相继出世。一、
4、转基因动物概述一、转基因动物概述 2 2 “硕鼠硕鼠 19821982年，年，PalmiterPalmiter和和BrinsterBrinster用用此方法把大鼠的生长激素基因导入小鼠此方法把大鼠的生长激素基因导入小鼠受精卵，获得了“硕鼠受精卵，获得了“硕鼠，首先证明外，首先证明外源基因可在受体中表达，并且表达产物源基因可在受体中表达，并且表达产物具有生物活性。具有生物活性。4)4)利用转基因生产重组蛋白利用转基因生产重组蛋白 1987年，Simons等在转基因小鼠的乳汁中得到绵羊的-球蛋白，1988年，该研究小组又从转基因绵羊的乳汁中得到了-抗胰蛋白酶。目前，已有多种蛋白实现了转基因生产。一
5、、转基因动物概述一、转基因动物概述 目前转基因动物主要应用在生物学根底研究、目前转基因动物主要应用在生物学根底研究、医学疾病模型、动物生物反响器、异种器官移植、医学疾病模型、动物生物反响器、异种器官移植、动物遗传改进等动物遗传改进等5 5个方面。个方面。转基因动物实例转基因动物实例 超级奶牛普通奶牛的三倍大 英国 国内首例绿色荧光蛋白“转基因克隆猪东北农业大学 正在进行转基因山羊的实验 乳汁中分泌人凝血因子IX的转基因山羊 上海交通大学医学遗传研究所 转基因动物实例转基因动物实例 人兽杂交人兽杂交 英国英国?每日邮报每日邮报?2022?2022年年7 7月月2323日报道，英国多家实验室在过去
6、日报道，英国多家实验室在过去3 3年中一直秘密进行人兽杂交胚胎年中一直秘密进行人兽杂交胚胎的实验，并且已经制造了的实验，并且已经制造了150150多个多个同时包含人类和动物基因的杂交同时包含人类和动物基因的杂交胚胎。胚胎。这些实验都是在这些实验都是在?人类受精与人类受精与胚胎学法案胚胎学法案?公布之后实施的，目公布之后实施的，目的据称是为了通过胚胎干细胞的的据称是为了通过胚胎干细胞的研究为多种疾病寻找有效的疗法。研究为多种疾病寻找有效的疗法。?人兽杂交?，2022 just a joke 获取外源目的基因获取外源目的基因 重组载体导入生殖细胞或胚胎干细胞重组载体导入生殖细胞或胚胎干细胞 选择体
7、外培养系统和宿主动物选择体外培养系统和宿主动物 转基因胚胎的发育及鉴定转基因胚胎的发育及鉴定 筛选所得的转基因动物筛选所得的转基因动物 二、转基因动物操作技术流程二、转基因动物操作技术流程 转基因动物的载体系统转基因动物的载体系统 病毒载体系统病毒载体系统 非病毒载体系统非病毒载体系统 腺病毒载体腺病毒载体 反转录病毒载体反转录病毒载体 腺相关病毒载体腺相关病毒载体 单纯疱疹病毒载体单纯疱疹病毒载体 慢病毒载体慢病毒载体 表达型质粒载体表达型质粒载体 定向打靶载体定向打靶载体 随机基因敲除载体随机基因敲除载体 二、转基因动物操作技术流程二、转基因动物操作技术流程 病毒载体的缺乏：诱导机体的免疫
8、反响，存在致毒、病毒载体的缺乏：诱导机体的免疫反响，存在致毒、致癌的危险、载体容量有限、制备滴度不高等致癌的危险、载体容量有限、制备滴度不高等 非病毒载体的优势：非病毒载体的优势：1.1.对对DNADNA大小的限制较少，长达大小的限制较少，长达48kb48kb的片段已被成的片段已被成功转移至细胞。功转移至细胞。2.2.没有对包装和复制所必需的病毒序列的要求，没有对包装和复制所必需的病毒序列的要求，DNADNA易操纵易操纵 3.DNA3.DNA复合物不大可能有感染能力，比较平安。复合物不大可能有感染能力，比较平安。4.4.关于免疫原性，存在问题较少。关于免疫原性，存在问题较少。要求：要求：1 1
9、、携带外源基因并能包装成感染性病毒颗粒、携带外源基因并能包装成感染性病毒颗粒 2 2、介导外源基因转移和表达、介导外源基因转移和表达 3 3、对机体不致病、对机体不致病 1 1、动物基因工程载体、动物基因工程载体 之之 病毒载体病毒载体 优点：优点：1 1、利用感染性进入细胞，转导效率高；、利用感染性进入细胞，转导效率高；2 2、复杂的装配过程由细胞完成；、复杂的装配过程由细胞完成；3 3、不同的病毒载体具有不同的表达特点。、不同的病毒载体具有不同的表达特点。二、转基因动物操作技术流程二、转基因动物操作技术流程 1)1)逆转录病毒载体逆转录病毒载体 1 1、动物基因工程载体、动物基因工程载体
10、之之 病毒载体病毒载体 二、转基因动物操作技术流程二、转基因动物操作技术流程 逆转录病毒的生物学特性逆转录病毒的生物学特性 逆转录病毒是单链RNA病毒，侵染细胞后表达出自身的反转录酶，以单链的RNA基因组为模板，立即在寄主细胞中反转录成线性双链DNA，然后在整合酶Int介导下，整合到宿主基因组中此时整合的病毒序列被称为前病毒，并在每次细胞分裂时，随宿主DNA一起复制。逆转录病毒的生活周期逆转录病毒的生活周期 进入宿主细胞进入宿主细胞 单链单链RNARNA 逆转录酶逆转录酶 双链双链DNADNA 整合到宿主细胞基因组中整合到宿主细胞基因组中前病毒前病毒 宿主细胞宿主细胞RNARNA聚合酶聚合酶
11、RNARNA 病毒病毒RNARNA基因组基因组 作为合成相应作为合成相应 病毒蛋白质的模板病毒蛋白质的模板mRNAmRNA 包装成新的病毒颗粒，离开宿主包装成新的病毒颗粒，离开宿主 通常不致死宿主细胞通常不致死宿主细胞 LTRLTR gaggag polpol envenv LTRLTR 长末端长末端 重复序列重复序列 调节和调节和 启动转录启动转录 产生病毒产生病毒 核心蛋白核心蛋白 产生逆转产生逆转录酶录酶 产生病毒产生病毒 外膜蛋白外膜蛋白 包装信号包装信号 逆转录病毒的结构特征逆转录病毒的结构特征 逆转录病毒载体的构建逆转录病毒载体的构建 常用的是莫洛尼小鼠白血病病毒常用的是莫洛尼小鼠
12、白血病病毒(MoMLV)(MoMLV)构建的各类构建的各类逆转录病毒载体逆转录病毒载体 LTR gag pol env LTR 目的基因目的基因 标记基因标记基因 LTRLTR gaggag polpol envenv LTRLTR GagGag蛋白蛋白 PoLPoL蛋白蛋白 EnvEnv蛋白蛋白 包装细胞系包装细胞系 LTRLTR LTRLTR 靶细胞靶细胞 目的基因 标记基因 LTRLTR LTRLTR 目的基因 标记基因 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 假病毒颗粒的产生并感染靶细胞，在靶细胞中整合假病毒颗粒的产生并感染靶细胞，在靶细胞中整合至细胞基因组稳定表达至细胞基因组稳定表达
13、 逆转录病毒载体 重组逆转录病毒(核酸局部只能是逆转录病毒载体)辅病毒辅病毒 重组病毒重组病毒DNADNA转转染进染进包装细胞系包装细胞系中，包装细胞系中，包装细胞系产生将病毒产生将病毒RNARNA包装成感染性病包装成感染性病毒粒子的所有蛋毒粒子的所有蛋白质，但却不能白质，但却不能包装自身的包装自身的RNARNA 逆转录病毒载体稳定、长期表达外源基因逆转录病毒载体稳定、长期表达外源基因 特点：高效整合特点：高效整合 外源外源DNADNA长度长度一般不应超过一般不应超过8kb8kb 腺病毒的生物学特性 2)2)腺病毒载体腺病毒载体 1 1、动物基因工程载体、动物基因工程载体 之之 病毒载体病毒载
14、体 二、转基因动物操作技术流程二、转基因动物操作技术流程 腺病毒科为线状双链腺病毒科为线状双链DNADNA病毒，病毒，无包膜，呈二十面体，共有无包膜，呈二十面体，共有9393个成个成员，分哺乳动物腺病毒和禽腺病毒员，分哺乳动物腺病毒和禽腺病毒两个属。目前已鉴定的人腺病毒有两个属。目前已鉴定的人腺病毒有6 6个亚属，其中常用来构建载体的个亚属，其中常用来构建载体的主要是主要是C C亚属的亚属的2 2型型Ad2Ad2和和5 5型型Ad5Ad5病毒。病毒。腺病毒感染人细胞时呈腺病毒感染人细胞时呈裂解型裂解型，不致癌；但对啮齿，不致癌；但对啮齿目动物来说，绝大多数的腺病毒成员均能致癌。目动物来说，绝大
15、多数的腺病毒成员均能致癌。腺病毒的基因组腺病毒的基因组DNADNA ITR ITR E1 E2 E3 E4 IVa2 VA L1 L2 L3 L4 L5 腺病毒基因组腺病毒基因组DNADNA全长全长36 kb36 kb，其包装上限为原基因组的，其包装上限为原基因组的105%105%，DNADNA两端各有一个反向重复序列两端各有一个反向重复序列ITRITR；E1E1-E4E4为早期基因，与病毒为早期基因，与病毒基因组的复制及晚期基因的表达调控有关；基因组的复制及晚期基因的表达调控有关；L1L1-L5L5为编码病毒包装为编码病毒包装蛋白的晚期基因；蛋白的晚期基因；IVa2IVa2和和VAVA均为病
16、毒均为病毒RNARNA聚合酶的亚基编码基因。聚合酶的亚基编码基因。E3E3区缺失只会影响病毒颗粒的成熟，不影响基因组的复制功能，因而区缺失只会影响病毒颗粒的成熟，不影响基因组的复制功能，因而在构建载体时往往除去这个在构建载体时往往除去这个2.2 kb2.2 kb的片段，使得载体的装载量提高的片段，使得载体的装载量提高到到 4 kb4 kb以上。以上。E4E4区也可以被去除掉。区也可以被去除掉。腺病毒载体的构建腺病毒载体的构建 第一代腺病毒载体：第一代腺病毒载体：E3E3基因缺失的腺病毒载体，此类型载体基因缺失的腺病毒载体，此类型载体可引发机体产生较强的炎症反响和免疫反响，表达外源基因可引发机体产生较强的炎症反响和免疫反响，表达外源基因时间短。时间短。第二代腺病毒载体：第二代腺病毒载体：E2E2或或E4E4基因缺失的腺病毒载体，产生的基因缺失的腺病毒载体，产生的免疫反响较弱其载体容量和平安性方面亦改进许多。免疫反响较弱其载体容量和平安性方面亦改进许多。第三代腺病毒载体：缺失了全部的第三代腺病毒载体：缺失了全部的无病毒载体，无病毒载体，gutless gutless vectorvecto
