1、c a/T 1 8 0 8 6-2 0 0 0前言 烟霜霉病是我国进境植物检疫危险性病害，为了防止该病菌随寄主传人我国，在进境检疫时，需正确掌握烟霜霉病菌的检疫鉴定方法 本标准在制定过程中，经过调查研究，分析有关资料和总结多年的实践经验，以及根据烟霜霉病菌的生物学特性、病理学原理，确定各项技术指标。本标准给出烟霜霉病病原菌的抱囊梗和抱囊及卵抱子的形态特征，两者可同时或单独作为烟霜霉病菌的鉴定依据。本标准的附录A是提示的附录，附录中的“冰冻匀浆法”是检验烟霜霉病菌卵抱子的一种较先进的方法，但目 前在国内尚 未普及，故在检验烟霜霉病菌时，若条件允许，也可采用此法检验该病原产生的卵抱子本标准由农业部
2、提出本标准负责起草单位:中华人民共和国广东出入境检验检疫局。本标准主要起草人:李怡珍、章正、钟国强、张传飞。中华 人民 共 和 国国 家标 准 植物检疫烟霜霉病菌检疫鉴定方法c B/T 1 8 0 8 6-2 0 0 0 P l a n t q u a r a n t i n e-Me t h o d s f o r i n s p e c t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o no f P e r o n o s p o r a h y o s c y a m i d e B a r y f.s p.t a b a c i n a(A d a m)S
3、 k a l i c h y1 范围本标准规定了进境植物检疫中对烟霜霉病菌的检疫鉴定方法本标准适用于进境干烟叶和烟属植物种子、种苗的烟霜霉病菌检疫和鉴定。2 原理 烟霜霉病菌为专性寄生菌，烟叶被侵染为害后，出现边缘模糊、褪绿的近圆形斑点，后期形成淡褐色可脱落的坏死病斑。在适宜温湿度条件下，叶背面病斑长出淡蓝色霉状物，即烟霜霉病菌的抱囊梗和袍囊;在一定条件下，病组织内可形成卵抱子。病原菌的寄生专化性及其形态学特征是鉴定烟霜霉病菌的依据。3 仪器、试剂3.1 手持扩大镜。3.2 带光源的扩大镜。3.3 双目 解剖镜(l o x-5 0 x).3.4 显微镜(1 0 O X一1 0 0 O X)。3
4、.5 离心机(1 0 0 0 r/m i n-4 0 0 0 r/m i n).3.6 不锈钢筛(孔径6 0=).3.7 振荡器(2 0 0 r/m i n),3.8 0.0 2 m o l/L磷酸缓冲液(p H=7)o3.9 苯胺蓝。3.1 0 乳酚油 乳酚油配制:苯酚结晶(水浴加热溶化)2 0 m L、乳酸2 0 m L、甘油4 0 m L,蒸馏水2 0 m 工混合而成。3.1 1 1 o%氢氧化钾溶液 氢氧化钾溶液配制:取氢氧化钾1 0 g，加水9 0 m L溶解配成1 0%氢氧化钾溶液。4 抽样4 门抽查取样前查验待检烟叶的有关单证，核实产地、包装、啧头、品名、级别、收获年份及数量42
5、 用随机方法在货柜车、船舱、仓库堆位的上、中、下各层开件抽查，检查包内烟叶是否有可疑疫情随机在包内的各个部位取样，注意抽取等级差、叶色暗淡无光泽的烟叶带回室内检验4.3 抽查件数国家质量技术监督局2 0 0 0 一 0 4 一 2 6 批准2 0 0 0 一，0 一 0 1 实施c B/T 1 8 0 8 6-2 0 0 0 按货物批量总件数0.5%一 1 0%开件抽查取祥，5 0 0 件以下的抽查2 0 件，少于2 0 件的全批抽查。其余开件抽查件数如表工:表 1 进境烟 叶检疫抽杳表批量 2 5 件数，件抽查件数，件5 0 0 以 卜(含 5 0 0 了 十)5 01-1 0 0 021
6、3 01 0 0 1-3 0 0 03 1-4 03 001-5 0 0 04 1 5 07 0 0 1 一 1 0 0 0 0517 01 0 0 0 1以 I-7 1-1 0 04.4 取样质量 香料烟、打叶片 烟每 批取样6 k g-1 5 k g 扎把烟每批取样2 0 k g-4 0 k g e4.5 烟属种子、种苗的抽样每批按2，件数的5 Yo-2 0%抽查，种子每批取样检验2 0 g-5 0 g，种苗每批取样检验 1 0 0株以上，少于 1 0。株的全检。5 烟叶检验方法5.1 病叶检查 在光线充足处，逐片 检查烟叶有无烟霜霉病的可疑症状，叶背有无灰褐色的霜霉层5.2 病原菌检验5
7、.2，直接镜检 用 解剖针挑取病斑上的霉状物制片镜检，用显微镜观察有无病原菌的泡囊梗和饱囊，记录其形态特征，必要时测量袍囊梗的长度和抱囊的大小。5.2.2 洗涤检验 将未发现霜霉层的可疑病斑及碎片，置2 5 0 m l _ 三角瓶内，加人适量蒸馏水浸软后，用振荡器激烈震荡5 m i n，洗下病斑表面的病原物，将洗涤液倒进离心管，以1 0 0 0 r/m i n 离心5 m i n,倾去上层清液，取沉淀液置载玻片上，盖上盖玻片，用显微镜检查有无烟霜霉病菌的抱囊梗和抱囊，每批样品至少检查1 0 个玻片5.2.3 叶组织透明法检验卵抱子 选取病叶上霉状物稀少的老病斑置于小烧杯中，加适量 1 0 0
8、0 氢氧化钾溶液(或其他叶组织透明试剂)，煮沸5 m i n-1 0 m i n 至叶组织透明，加。.0 5%苯胺蓝(棉蓝)乳酚油作浮载剂，置显微镜下逐片观察有无卵抱子5.2.4 冰冻匀浆法检验卵抱子(见附录A)5.3 样品的保存 经检验完毕的 大宗烟叶的样品，香料烟、打叶片烟等每批留 样1 k g-2 k g，扎把烟每批留样2 k g-4 k g，注明烟样的合同号、产地、品名、级别、收获年份、抽样地点、时间 等项目 后分别存放于干燥、防虫处保存2 个月。发现有烟霜霉病叶的样品，至少保存6 个月，以备复检、谈判和仲裁。保存期满后需作灭菌处理6 烟属植物的种子、种苗检验方法6 门种子检验 随机选
9、取种子1 0 g-3 0 g(含种子中夹杂的残株碎屑)，用5.2.2 条方法洗涤检验 该方法主要检验G B I T 1 8 0 8 6-2 0 0 0夹杂在种子中的残株碎屑是否带烟霜霉菌的袍囊梗和抱囊)6.2 种苗检验 检查种苗叶片背而有无烟霜霉病症状，如有霜霉层，可用5.2.1 条方法镜捡病原的抱囊梗和抱囊对可疑烟苗，须作保湿脸查 将叮疑烟苗叶片展平，放入预制的直径1 5 c m-2 0 c m铺有3 层湿滤纸的玻抓中，加盖后形成小型湿室，置1 8 C 下无光照诱发培养 1 2 h-2 4 h，然后在双目 镜下仔细检查有无新生的烟霜霉病的袍囊梗和抱囊了 鉴定特征 烟霜霉病菌的抱囊梗无色，从寄
10、主气孔中伸出，主 轴较粗壮，上部呈双叉分枝3 次t o 次。抱囊梗长4 0 0 1 x m-7 5 0 p m,宽7 y m-1 1 u m;分枝角度越分越大，末枝呈钝角分叉 叉枝基部略粗并向末端变尖 两叉枝长 短略有差异，较长的一 枝常弯曲，另一枝较直，末枝长7 1 Z m一1 4 p m;饱囊在末枝顶端同步形成，易脱落、无色或淡黄色，柠檬形或卵形，无乳头状突起，大小为(1 7 i m -2 8 j m)X(1 3 p。一1 7 k m)q 袍囊壁薄、厚度均匀。烟霜霉病菌的卵抱子壁与藏卵器壁分离。成熟卵抱子呈桔黄至红褐色，球形，直径为2 0 k m一6。k m，外胞 壁常 有瘤 状饰纹8 结
11、果判定 从 烟叶上发现的霜霉病菌的 抱囊梗和泡囊或卵抱子，符合上述形态特征的可鉴定为 烟霜霉病菌G B/T 1 8 0 8 6-2 0 0 0 附录A (提示的附录)冰冻匀浆法检验卵抱子A1 原理 烟霜霉病菌的卵袍子产生于病叶的组织内，病叶经冰冻匀浆使大多数叶肉 组织、气孔细胞及维管束组织破碎，而卵抱子仍完整，通过网筛过滤、离心匀浆液，可收集较高浓度的卵抱子。A 2 方法 取直 径为1 c m烟霜霉病病斑或可疑叶碟，称量，每。.1 g 叶碟(约含叶碟1 5 个一2。个)，加磷酸缓冲液(p H-7.O,p b s)2 n i l，用玻棒搅拌，在室温下静贵1 5 m i n，放入一1 8 C 冷冻室内 速冻2 h，取冰冻叶碟移入匀浆器内 加(1-2)m L p b、冲洗，匀浆4 m i n-6 m i n,用孔径为6 0 p m的不锈钢网筛过滤，并不断冲洗筛网 收集滤液 以1 0 0 0 r/m i n 转速离心3 m i n，倾去上清液，加乳酚油定容至1 m 工 J，每批样品至少检查 1 0 个玻片，记录卵饱子的数量
