1、 ICS 11.220 CCS B 41 DB42 湖北省地方标准 DB42/T 1864.12022 家禽疫病诊断技术规程 第 1 部分：家禽主要肿瘤病病原鉴别 Code for practice diagnostic techniques of poultry diseases series Part 1:Technical specification for differential diagnosis of major neoplastic diseases in poultry 2022-04-25 发布 2022-06-25 实施 湖北省市场监督管理局 发 布 DB42/T 186
2、4.12022 I 目次 前言.II 引言.III 1 范围.4 2 规范性引用文件.4 3 术语和定义.4 4 缩略语.4 5 原理.5 6 试验条件.5 7 仪器设备.5 8 试剂或材料.5 9 试验步骤.6 10 结果判定.7 11 生物安全措施.7 DB42/T 1864.12022 II 前 言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件DB42/T 1864家禽疫病诊断技术规程为系列标准。本部分为DB42/T 1864的第1部分。DB42/T 1864发布了以下部分：第 1 部分：家禽主要肿瘤病病原鉴别。第 3 部分：鸡
3、沙门氏菌、产气荚膜酸菌和空肠弯曲菌三重荧光 PCR 检测方法。请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所提出。本文件由湖北省农业农村厅归口管理。本文件起草单位：湖北省农业科学院畜牧兽医研究所、湖北省动物疫病预防控制中心。本文件主要起草人：罗青平、汪最、邵华斌、汪宏才、裴洁、温国元、张蓉蓉、张腾飞、张文婷、卢琴、商雨、曾哲、曾勇、陈军涛。本文件实施应用的疑问，可咨询湖北省农业农村厅，联系电话：027-87665821，邮箱：；在执行过程中有意见和建议请及时反馈至湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，联系电话：027-87284950
4、，邮箱：。DB42/T 1864.12022 III 引 言 近年来，我国高度重视动物传染病的预防和控制工作，在国务院颁布的国家中长期动物疫病防治规划（20122020年）中明确要求进一步做好种禽场疫病净化、加强疫病检测诊断能力建设。家禽及蛋制品产业链是湖北省的十大重点产业链之一，为了加快湖北省重点农业产业链建设，保证家禽养殖健康与食品安全，依据湖北省重点农业产业链实施方案，对影响家禽及蛋制品产业链的禽白血病、禽致病性大肠杆菌、沙门氏菌等家禽重要疫病开展快速检测方法研究。为加快我省家禽疫病净化进程，提升疫病的监测、检测效率，促进我省家禽业持续健康发展，起草组围绕家禽疫病防控的需要，研制了 家禽
5、疫病诊断技术规程系列标准，拟由4个部分构成。第一部分：家禽主要肿瘤病病原鉴别。目的在于开展家禽 J 亚群白血病病毒、马立克氏病病毒、网状内皮组织增生症病毒的快速检测，指导家禽肿瘤病的快速鉴别诊断。第二部分：禽大肠杆菌致病群双重探针法检测。目的在于检测家禽泄殖腔拭子和粪便中的致病群大肠杆菌，指导家禽致病群大肠杆菌的快速检测。第三部分：鸡沙门氏菌、产气荚膜梭菌和空肠弯曲菌三重荧光 PCR 检测方法。目的在于检测鸡肉及相关产品、鸡泄殖腔拭子和粪便中的沙门氏菌、产气荚膜梭菌和空肠弯曲菌，指导鸡肉及相关产品细菌性疾病的快速检测。第四部分：禽白血病抗原 ELISA 检测方法。目的在于检测种鸡群蛋清、血浆、
6、精液、胎粪、肛拭子中禽白血病抗原 ELISA 检测，指导种鸡场禽白血病的净化检测。DB42/T 1864.12022 4 家禽疫病诊断技术规程 第 1 部分：家禽主要肿瘤病病原鉴别 1 范围 本文件规定了家禽J亚群白血病、马立克氏病、网状内皮组织增生症三重荧光PCR检测方法所需检测样品、仪器与设备、试剂与材料、检测步骤及结果判定。本文件适用于家禽J亚群白血病病毒、马立克氏病病毒、网状内皮组织增生症病毒的快速鉴别诊断。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有
7、的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 GB/T 27403 实验室质量控制规范食品分子生物学检测 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 荧光PCR realtime PCR 一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。ALV：禽白血病病毒（Avian Leukosis Virus）BHQ1：黑洞淬灭剂-1（Black Hole Quencher-1）Ct值：循环阈值（Cycle threshold）FAM：荧光素酰胺（Fl
8、uorescein Amidite）JOE：4,5-二氯二甲氧基荧光素（4,5-Dichloro-dimethoxy-fluorescein）LTR：长末端重复序列（Long Terminal Repeat）MDV：马立克氏病病毒（Mareks Disease Virus）PCR：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）qPCR：实时定量聚合酶链式反应（Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction）REV：网状内皮组织增生症病毒（Reticuloendotheliosis Virus）TAMRA：羧四甲基罗丹明（C
9、arboxytetramethylrhodamine）DB42/T 1864.12022 5 5 原理 本文件采用多重荧光PCR法鉴别家禽组织样本中J亚群禽白血病病毒、网状内皮组织增生症病毒、马立克氏病病毒的存在，该方法的原理是：根据三种病毒的保守基因序列ALV-J的env基因、REV的LTR区和MDV的meq基因，设计特异的引物和荧光探针，并以三种不同荧光标记三条探针，建立了三种肿瘤病病毒三重荧光定量PCR检测方法。在样品检测时，样品cDNA经PCR扩增与探针杂交，根据对应荧光强度判断是否存在禽J亚群白血病病毒、马立克氏病病毒、网状内皮组织增生症病毒。6 试验条件 实验操作应在室温（1825
10、）下进行。样品前处理应在二级生物安全柜中进行。7 仪器设备 7.1 荧光定量 PCR 仪。7.2 二级生物安全柜。7.3 台式冷冻小型离心机（转速12000 r/min）。7.4 微量移液器（2.5 L、10 L、200 L、1 mL）。7.5 冷藏冷冻冰箱。7.6 组织匀浆机。7.7 高压灭菌锅。8 试剂或材料 8.1 试剂配制 本方法试验用水应按照GB/T 6682中规定的二级水，所有实验用试剂均为分析纯。试剂配制按照GB/T 27403的规定执行。8.2 试剂或材料 8.2.1 荧光定量 PCR 探针预混物、反转录酶。8.2.2 PBS 缓冲液：NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na
11、2HPO4 1.42 g（Na2HPO412H2O 3.58 g），KH2PO4 0.27 g溶于蒸馏水，定容为 1000 mL，过滤后高温高压灭菌备用。8.2.3 商品化的 DNA/RNA 提取试剂盒。8.2.4 J 亚群禽白血病病毒引物与探针：上游引物 5-GCAAGAAGGACTCTAAGA-3，下游引物 5-GGTTGTTGCAATAGATGAA-3，探针 5-JOE-CCGCCAGCAACAAGCAAGAA-BHQ1-3。8.2.5 网状内皮组织增生症病毒引物与探针：上游引物 5-GATGCTTGCCTTCAACAAACATTTC-3，下游引物 5-ACTGCCATATTAGCTTC
12、TGTAATCATG-3，探针 5-FAM-AGCCTGCTCTTGATGCCGATTCCGA-BHQ1-3。8.2.6 马立克氏病病毒引物与探针：上游引物 5-CATGCTTCATGGAGTTTGTCTACATAG-3，下游引物 5-GCCTATCTGAGGAGGAGAAACAGAA-3，探针 5-TAMRA-CCGTCTGCTTCCTGCGTCTTCTCCGAG-BHQ1-3。8.2.7 阳性对照：分别携带 ALV-J 的 env 基因、REV 的 LTR 区和 MDV 的 meq 基因的阳性质粒标准品。8.2.8 阴性对照：无菌蒸馏水或去离子水。DB42/T 1864.12022 6 8
13、.2.9 无 DNase/RNase 的 PCR 管、微量移液器枪头。9 试验步骤 9.1 样品的采集与保存 9.1.1 组织样品 无菌操作采集疑似病鸡的肿瘤样品或肝脏、肾脏、脾脏等组织1 g2 g，装入无菌15 mL离心管中。9.1.2 精液样品 左手自公鸡的背部向后至尾根按摩数次，右手中指和无名指夹着集精杯无菌采集精液。9.1.3 血液样品 无菌抽取病鸡1 mL静脉血，2000 rpm离心，制备血浆。9.1.4 细胞培养物样品 将接种病毒的细胞培养物置于-70备用。9.1.5 样品保存 样品采集后应编号，在28条件下保存应不差过24 h；若需长期保存，应放置-70冰箱。采集的样品密封后，采
14、用保温壶或保温桶加冰密封，在6 h8 h之内运送到实验室。按照兽医实验室生物技术安全管理规范进行样品生物安全标识。9.2 样品 cDNA 的制备 9.2.1 样品前处理 在生物安全柜中取组织样大约200 mg于1.5 mL离心管中，按照1:4的体积比加入无菌的PBS，进行匀浆处理；将组织匀浆液（精液、血浆、细胞培养物）反复冻融3次，12000 rpm/min离心5 min，取200 L上清，备用。9.2.2 DNA/RNA 提取 按照商品化的DNA/RNA提取试剂盒说明提取上清中的RNA/DNA，并使用反转录酶将RNA反转录为cDNA，cDNA置于-20保存备用。9.3 荧光 PCR 检测 9
15、.3.1 反应体系 反应体系体积为25 L，荧光定量PCR探针预混物12.5 L，ALV-J引物（10 mol/L）为0.4 L，REV和MDV引物（10 mol/L）为0.6 L；探针浓度（10 mol/L）ALV-J为0.5 L，REV为0.6 L和MDV为0.4 L，模板DNA 1 L，用灭菌的去离子水补足体积至25 L。9.3.2 反应条件 DB42/T 1864.12022 7 荧光PCR反应在多通道荧光定量PCR仪上进行，选择荧光信号TAMRA、FAM和JOE（分别检测马立克氏病病毒-TAMRA，网状内皮组织增生症病毒-FAM，J亚群禽白血病病毒-JOE）。反应参数为955 min
16、，然后9510 sec，6030 sec，进行40个循环，其中在51进行三重荧光信号检测。阈值设置为阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点。9.3.3 对照 检测过程中分别设阳性对照与阴性对照。10 结果判定 10.1 质控标准 阴性对照（无菌水）无特异性扩增曲线或Ct值大于38，阳性对照品TAMRA、FAM和JOE通道检测结果的Ct值均不大于35，且扩增曲线明显呈对数增长，则判定检测结果成立；如果阴性对照或者阳性对照有一项不符合标准则本次检测无效。10.2 结果分析 检测结果的判定应按照表1规定。表1 检测结果的判定 通道 Ct 值 结果判断 TAMRA 35 报告为 MDV 荧光 PCR 检测阳性 无 Ct 值或38 检测样品低于检测限或没有，报告为 MDV 荧光 PCR 检测阴性 3538 Ct 值在 3538 之间为灰值区域，对样品重新提取基因组，再检测一次，重做后如仍为 3538 报告为 MDV 荧光 PCR 检测阴性 FAM 35 报告为 REV 荧光 PCR 检测阳性 无 Ct 值或38 检测样品低于检测限或没有，报告为 REV 荧光 PCR 检测阴性 3538 Ct
