1、ICS 11.220B 41DB34 安徽省地方标准 DB 34/T 32832018副猪嗜血杆菌的分子分型 MLST 方法 Multilocus sequence typing detection method for Haemophilus parasuis 文稿版次选择 2018-12-29 发布2019-01-29 实施安徽省市场监督管理局 发 布DB34/T 32832018I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。本标准由安徽农业大学提出。本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：安徽农业大学、安徽浩翔农牧有限公司、安徽省动物卫生监督所、阜阳
2、市动物卫生监督所、合肥市动物疫病预防与控制中心、安徽省兽药饲料监察所、同济大学。本标准主要起草人：李郁、陈章、李雪松、张利亚、黄晓慧、刘晓露、孙裴、汪清峰、张劲松、高亚飞、孟天恺。DB34/T 328320181 副猪嗜血杆菌的分子分型 MLST 方法 1 范围 本标准规定了副猪嗜血杆菌的分子分型 MLST 的术语和定义、试剂和材料、仪器和设备、操作步骤、生物安全及防污染措施。本标准适用于副猪嗜血杆菌的分子分型检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。G
3、B/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫 NY/T 2417 副猪嗜血杆菌 PCR 检测方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 管家基因 house-keeping genes 所有细胞中均要表达的一类基因，其产物是维持细胞生命活动所必需的，其基因序列高度保守并且在大多数情况下持续表达。4 试剂和材料 除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水符合 GB/T 6682 中一级水的要求。所有试剂均用无 DNA 酶污染的容器分装。4.1 细菌基因组 DNA 提取试剂盒。4
4、.2 普通琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒。4.3 Taq DNA 酶。4.4 dNTP：dATP、dTTP、dCTP、dGTP。4.5 引物：扩增引物和测序引物序列见附录 A 表 A.2。4.6 10PCR 缓冲液：200 mmoI/L Tris-HCl（pH 8.4），200 mmol/L 氯化钾，15 mmol/L 氯化镁。4.7 琼脂糖凝胶。4.8 Gelred 核酸染色剂。4.9 6 溴酚蓝上样缓冲液。DB34/T 328320182 4.10 分子量标记：1000 bp DNA marker。4.11 5TBE 电泳缓冲液：445 mmoI/L Tris，445 mmol/L 硼酸，
5、10 mmol/L EDTA(pH 8.0）。使用时稀释为 0.5 TBE 电泳缓冲液。4.12 质控菌株：副猪嗜血杆菌。5 仪器和设备 5.1 离心机：最大转速 14 000 r/min 以上。5.2 天平：量程 2 kg，感量 0.1 g。5.3 pH 计。5.4 涡旋振荡器。5.5 PCR 仪。5.6 电泳仪。5.7 凝胶成像仪。5.8 超净工作台5.9 微量移液器：0.1 L2.5 L、0.5 L10 L、5 L50 L、20 L200 L、100 L1 000 L。6 操作步骤 6.1 细菌基因组 DNA 提取 采用细菌基因组 DNA 提取试剂盒，提取经过 NY/T 2417 的方法
6、鉴定为副猪嗜血杆菌的 DNA。6.2 MIST 基因选择 按附录A 表A.1 所示，对副猪嗜血杆菌的 7 个管家基因进行 MLST 分析。6.3 PCR 扩增引物和测序引物的选择 按附录A 表A.2 中的序列，合成副猪嗜血杆菌 7 个管家基因对应的 7 对 PCR 扩增引物和测序引物。引物在使用前按照引物合成时的既定浓度进行稀释到 10 mol/L，-20保存备用。6.4 管家基因片段的 PCR 扩增 反应体系体积为 50 L:10PCR 缓冲液 5 L、dNTP(2.5 mmol/L)4 L、上下游引物各(10 mol/L)1 L、Taq DNA 聚合酶(5 U/L)0.5 L、模板 DNA
7、 5L、去离子水补齐至 50 L。反应条件为：预变性 95 5 min；变性 95 60 s，退火 45 30s，延伸 72 30 s，进行 35个循环；72再延伸 10 min。将 PCR 产物进行 1琼脂糖凝胶电泳，在波长为 256 nm 的紫外光下成像观察，出现标准 Marker条带和依次单一且明亮的条带时，对相应样品进行 PCR 产物纯化。6.5 PCR 产物纯化 利用普通琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒并按照试剂盒所规定的操作步骤对 PCR 产物进行纯化。6.6 DNA 序列测定 DB34/T 328320183 采用附录A 表A.2 的测序引物，对纯化的 PCR 产物进行 DNA 序
8、列双向测序。6.7 结果报告 将所得到的副猪嗜血杆菌 7 个管家基因测序结果与 GenBank 中的已有的相关基因进行 BLAST，然后使用 Lasergene7.1 对序列进行 Clustal V 分析，将上下游序列整合后得到完整序列，为减小误差首尾的几个碱基不计算入序列测定结果。最后将测序结果上传至 MLST 网站(https:/pubmlst.org)进行在线数据分析，得到的结果与 MLST 数据库进行比对。将所得到的副猪嗜血杆菌 7 个管家基因核酸扩增片段 DNA 序列进行 MLST 分析，获得菌株所对应的等位基因图谱，确定副猪嗜血杆菌分离株的序列型（Sequence Type，ST）
9、，并与 PubMLST 数据库中国际菌株的资料进行比较。在确定 STs 的基础上应用 eBURST 程序将菌株分为各个谱系组（clonal complex），构建系统遗传进化树（参见附录B)。7 生物安全及防污染措施 7.1 生物安全措施 按照 GB 19489 中的有关规定执行。7.2 防污染措施 防污染措施应符合 GB/T 27401 的规定。DB34/T 328320184 A A 附 录 A（规范性附录）副猪嗜血杆菌多位点序列分型的管家基因及引物序列 表A.1 副猪嗜血杆菌的管家基因 基因名称 片段大小 bp 管家基因名称 atpD 519 ATP 合成酶链基因（chain of AT
10、P synthase）infB 399 翻译起始因子 IF-2 基因（translation initiation factor IF-2）mdh 444 苹果酸脱氢酶基因（malate dehydrogenase gene）rpoB 330 核糖体蛋白亚基基因（ribosomal protein subunit）6pgd 465 6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因（6-phosphogluconate dehydrogenase）g3pd 441 3-磷酸甘油醛脱氢酶基因（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）frdB 453 延胡索酸还原酶基因（fumar
11、ate reductase B）表A.2 副猪嗜血杆菌管家基因扩增（测序）的引物序列 引物名称 序列（53）atpD（Forward）atpD（Reverse）infB（Forward）infB（Reverse）mdh（Forward）mdh（Reverse）rpoB（Forward）rpoB（Reverse）6pgd（Forward）6pgd（Reverse）3gpd（Forward）3gpd（Reverse）frdB（Forward）frdB（Reverse）CAAGATGCAGTACCAAAAGTTTA GACCTTCATCACGGAATTT CTATATCCGTAAAGCGAAAGT
12、ACGACCTTTATCGAGGTAAG GCACTTTATGATATTGCCCC TTCCGTACCTGCATTTTG CTTCGGTTCATCACAACTTTC CGTCCATATAGTGAATTTCTTC AAACCACGCAAAGTGATGT CGTTGATCTTTGAATGAAGA GGTCAAGACATCGTTTCTAAC TCTAATACTTTGTTTGAGTAACCAG GTTGGTCTTGCCGTATGG TTAGCACTTTCGATCTTACCTT DB34/T 328320185 B B 附 录 B（规范性附录）系统遗传进化树的构建 将所得到的副猪嗜血杆菌 7 个管家基因核酸扩增片段 DNA 序列进行 MLST 分析，获得菌株所对应的等位基因图谱，确定副猪嗜血杆菌分离株的序列型（Sequence Type，ST），并与 PubMLST 数据库中国际菌株的资料进行比较。在确定 STs 的基础上应用 eBURST 程序将菌株分为各个谱系组（clonal complex），构建系统遗传进化树。图B.1 为副猪嗜血杆菌进行 MLST 分析后绘制的系统遗传进化树图。图B.1 副猪嗜血杆菌系统遗传进化树图 _
