1、广 东 省 食 品 安 全 地 方 标 准DB 44DBS 44/013-2019纳豆粉2019-12-01 实施2019-07-11 发布广广 东东 省省 卫卫 生生 健健 康康 委委 员员 会会发布DBS 44/013-2019I前言本标准为首次发布。DBS 44/013-20191纳豆粉1范围本标准适用于纳豆粉。2定义2.1纳豆粉以大豆为原料，添加或不添加其他辅料，经枯草芽孢杆菌发酵、干燥、粉碎等工艺加工而成的粉末状发酵豆制品。3技术要求3.1原料要求3.1.1大豆：应符合 GB 2715 和 GB 1352 的要求。3.1.2所有原辅料：应符合 GB 2761、GB 2762、GB 2
2、763、GB 2763.1 以及相应食品标准的有关规定。3.2感官要求应符合表1的规定。表1 感官要求项目要求检验方法色泽浅黄色至黄褐色取适量试样置于白色洁净瓷盘中，在自然光下观察色泽、性状和杂质，闻其气味，品其滋味。气味、滋味具有纳豆粉特有的气味、滋味，无异味性状粉末状，无结块杂质无正常视力可见外来杂质3.3理化指标应符合表 2 规定。表2 理化指标项目要求检验方法纳豆激酶aFU/g2000附录 A 紫外分光光度法IU/g13000附录 B 琼脂糖纤维蛋白平板法DBS 44/013-20192蛋白质b，g/100g20GB 5009.5水分，g/100g7.0GB 5009.3灰分，g/10
3、0g6.0GB 5009.4a纳豆激酶用附录 A 或附录 B 其中一个方法检测符合相应要求即视为合格。b氮折算成蛋白质的系数，以 6.25 计。3.4污染物限量应符合表 3 的规定。表3污染物限量项目要求检验方法铅（以 Pb 计），mg/kg0.5GB 5009.123.5真菌毒素限量应符合表 4 的规定。表4真菌毒素限量项目要求检验方法黄曲霉毒素 B1，g/kg5.0GB 5009.223.6微生物限量应符合表 5 的规定。表5 微生物限量项目采样方案a及限量检验方法ncmM大肠菌群，CFU/g521001000GB 4789.3 平板计数法沙门氏菌，/25g500-GB 4789.4金黄色
4、葡萄球菌，CFU/g511001000GB 4789.10 第二法a样品的采样及处理按 GB 4789.1 和 GB/T 4789.21 执行。n 为同一批次产品应采集的样品件数；c 为最大可允许超出 m 值的样品数；m 为致病菌指标可接受水平的限量值；M 为致病菌指标的最高安全限量值。3.7食品添加剂要求3.7.1食品添加剂的使用应符合 GB 2760 对发酵豆制品的规定。DBS 44/013-20193附录 A纳豆激酶测定方法-紫外分光光度法A.1 范围本方法适用于纳豆粉中纳豆激酶的测定。本方法的检测浓度范围为 0.671.33 FU/mL。A.2 原理纳豆粉中的纳豆激酶与纤维蛋白发生反应
5、，使纤维蛋白肽键水解。水解反应使溶液在紫外光 275 nm 处吸光度发生变化。用紫外分光光度计测定水解反应前后吸光度的变化，通过换算间接得出纳豆激酶的活力，单位用 FU 表示。一个活力单位（1 FU）是指在 275 nm 下，使吸光度值每增加 0.01 时消耗的酶量。A.3 试剂配置A.3.1实验用水为一级水。A.3.2磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）：分析纯；A.3.3磷酸二氢钠（NaH2PO42H2O）：分析纯；A.3.4氯化钠（NaCl）：分析纯；A.3.5盐酸（HCl）：分析纯；A.3.6三氯乙酸（TCA）：分析纯；A.3.7纤维蛋白原：CAS：9001-32-5，SIGMA，提
6、取自牛血浆，产品编号 F8630，规格：5 g/瓶，含量：65-85%；A.3.8凝血酶：CAS：9002-04-4，SIGMA，提取自牛血浆，产品编号 T4648，规格：21.6mg/瓶，含量：1 KU；A.3.9醋酸（CH3COOH）：分析纯；A.3.10醋酸钠（CH3COONa3H2O）：分析纯；A.3.11Triton X-100：分析纯；A.3.12硫酸钙（CaSO42H2O）：分析纯；A.3.130.01mol/L 磷酸盐缓冲溶液（pH6.8，含 NaCl）精密称取 3.58 g 磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O），加水溶解并稀释定容至 1.0 L，配成溶液 A，精密称取 0.
7、78 g 磷酸二氢钠(NaH2PO42H2O)，加水溶解并稀释定容至 500 mL，配成溶液 B，将溶液 A 和 B 混合，配成 pH 值为 7.5 的磷酸缓冲溶液（约取 A 液 84 mL，16 mLB 液）；取上述 pH 值为 7.5 的磷酸缓冲溶液与 0.9%的氯化钠溶液混合，混合比例约为 1:17，配成 pH 值为 6.8 的磷酸盐缓冲溶液。DBS 44/013-20194A.3.140.2 mol/L 三氯乙酸（TCA）溶液：精密称取 32.68 g TCA，用适量去离子水溶解并稀释至 1000 mL 即得。A.3.150.96纤维蛋白原溶液：移取 10 mL 磷酸盐缓冲液（0.01
8、 mol/L）至锥形瓶中，加入 96 mg 纤维蛋白原。超声使其完全溶解，防止起泡。A.3.16凝血酶溶液：临用前用 0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液稀释 50 倍。A.3.171 mol/L 醋酸溶液：精密称取 60.1 g CH3COOH，用适量去离子水溶解并稀释至 1000mL 即得。A.3.181 mol/L 醋酸盐缓冲液（pH 6.0）：精密称取 129.6 gCH3COONa3H2O，用约 500mL去离子水溶解，向其中加入 1 mol/L 醋酸溶液至 pH=6.0 后，用去离子水稀释至 1000 mL 即得。A.3.1910Triton X-100 溶液：称取 10 g Tri
9、ton X-100，在加热条件下用适量去离子水溶解，再补加去离子水至 100 mL 即得。A.3.20稀释剂：精密称取 0.334 g（终浓度 2mmol/L）CaSO42H2O 和 0.585 g（终浓度10 mmol/L）NaCl，用适量去离子水溶解，向其中加入 1 mol/L 醋酸盐缓冲液 2.0 mL（pH 6.0）以及 10Triton X-100 溶液 0.5 mL（最终浓度为 0.005）后，用去离子水稀释至 1000 mL即得。A.4 仪器和设备A.4.1水浴锅：（370.5）；A.4.2分析天平，感量为 0.1 mgA.4.3超纯水仪A.4.4pH 计A.4.5涡旋混合器A.
10、4.6离心机，转速12000 转/minA.4.710 mL 离心管A.4.8紫外可见分光光度计，配 1cm 石英比色皿A.5 测试A.5.1样品溶液制备准确称取适量样品（称样量根据不同样品中纳豆激酶的含量而定，大约保证样品溶液中纳豆激酶浓度在 0.671.33 FU/mL 之间），用稀释剂溶解，使最终反应液的校正吸光度（A）在 0.040.08 之间。A.5.2测定A.5.2.1 样品管DBS 44/013-20195A.5.2.1.1将 1.4 mL 0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液和 0.4 mL 0.96纤维蛋白原溶液加至 10mL 离心管中，370.5水浴中孵育 5 min。A.5
11、.2.1.2 取出加入 0.1 mL 凝血酶溶液并均匀混合。至 370.5水浴中孵育 10 min。A.5.2.1.3取出加入 0.1 mL 样品溶液，涡旋混合 5 s，至 370.5水浴中孵育 60 min。在分别达到孵育 20 min 和 40 min 时间点时，分别取出在涡旋混合器上再均匀混合 5 s 后，继续孵育。A.5.2.1.4至反应 60 min 时，加入 2 mL 0.2 mol/L TCA 终止反应液。将加过终止反应液的样品管继续混合均匀 5 s 后，于 370.5继续孵育 20 min，使终止反应完全。A.5.2.1.5 取出样品液进高速离心机，在 12000 rpm 条件
12、下离心 10 min。A.5.2.1.6 用移液管小心移取 2 mL 上清液至比色皿中，并于 275 nm 处测定吸光度（A）。A.5.2.2 样品空白管A.5.2.2.1 与样品管 A.5.2.1.1 和 A.5.2.1.2 同样操作。A.5.2.2.2 取出加入 2mL 0.2 mol/L TCA 终止反应液，均匀混合 5s。A.5.2.2.3 加 0.1 mL 样品溶液，均匀混合 5 s 后，放入 370.5水浴中孵育 20 min。A.5.2.2.4 接 A.5.2.1.5 和 A.5.2.1.6 操作，得样品空白管吸光度（A0）。A.6 结果计算样品中纳豆激酶 X（FU/g）按以下公
13、式计算：X=（A-A0）/(0.01600.1)D式中：A样品液吸光度；A0空白管吸光度；D样品的稀释率，D=定容体积（mL）/称样量（g）；计算结果表示到小数点后两位。A.7 检测质量控制标准在重复性条件下获得的独立测定结果的相对标准偏差不得超过 20%。A.8 分析步骤的关键控制点及说明A.8.1稀释剂可在室温下保存 15 天。过期重配。A.8.2样品溶液浑浊时需过滤，取滤液测试。A.8.3混合均匀操作需配合使用搅拌器。A.8.4要严格控制酶解反应时间。A.8.5酶对样品反应的影响较大。当实验更换了一批纤维蛋白原和凝血酶后，对同一批样品而言，结果有所不同。DBS 44/013-20196附
14、录 B纳豆激酶测定方法-琼脂糖纤维蛋白平板法B.1范围本方法适用于纳豆粉中纳豆激酶的测定。B.2原理纳豆激酶同尿激酶一样，是具有纤溶活性的物质。在含有凝血酶和纤维蛋白原琼脂糖平板的固体支架上，样品中的纳豆激酶和尿激酶标准系列同时发生溶纤反应，形成透明溶圈。以溶圈面积大小的对数为横坐标，浓度对数为纵坐标作回归曲线，得出相应的回归方程。根据回归方程计算样品中尿激酶活性大小。样品中的纳豆激酶以尿激酶活性大小 IU 计。B.3试剂与试液实验用水为符合 GB/T 6682 规定的一级水。B.3.1试剂B.3.1.1 磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）：分析纯；B.3.1.2 磷酸二氢钠（NaH2PO
15、42H2O）：分析纯；B.3.1.3 氯化钠（NaCl）：分析纯；B.3.1.4 琼脂糖B.3.1.5 纤维蛋白原（来源牛血）：CAS：9001-32-5；B.3.1.6 凝血酶（来源牛血）：CAS：9002-04-4；B.3.1.7 尿激酶：中国食品药品检定研究院B.3.2试液配制B.3.2.1 PBS 缓冲液的制备：0.01mol/L 磷酸盐缓冲液（pH 7.5）：称取磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）3.58 g，加双蒸水使溶解并稀释至 1000 mL 为液；取磷酸二氢钠(NaH2PO42H2O)0.78 g 加双蒸水使溶解并稀释至 500 mL 为液；将两液混合，调节至 pH 值为
16、 7.5（液取约 84 mL，液取约 16 mL）；0.9%氯化钠溶液：称取氯化钠 9 g，定容至 1 L，得到 0.9%氯化钠溶液。将 0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH 7.5）与 0.9%氯化钠溶液（1:17）混合，得到 PBS 缓冲液。B.3.2.2 1.5%琼脂糖溶液：取琼脂糖 1.5 g，加 PBS 缓冲液 100 mL，加热溶解，50水浴保温。现配现用。B.3.2.3 纤维蛋白原溶液DBS 44/013-20197取纤维蛋白原适量，加 PBS 缓冲液制成每 1 mL 中含 1.5 mg 蛋白的纤维蛋白原溶液。注意：缓慢加入 PBS 缓冲液，防止产生气泡，加冰超声溶解。B.3.2.4 凝血酶溶液取凝血酶适量，加入 0.9%氯化钠溶液制成每 1 mL 中含 1-2U 或 1-2BP 单位的溶液（根据不同试剂标签标识单位而定）。B.3.2.5 尿激酶标准系列溶液的制备：取尿激酶标准品，按标示效价加入所需 PBS 缓冲液溶解，配制的尿激酶标准溶液为 1000IU/mL，按表 B.1 继续配制尿激酶标准系列溶液。表 B.1 尿激酶标准系列溶液配制尿激酶对照系列溶液浓度 IU/
