1、ICS 71.040.40 B04 DB21 辽宁省地方标准 DB 21/T 22882014 养殖水体中孔雀石绿残留量的测定 液相色谱串联质谱法 Determination of malachite green residues in aquaculture water by HPLC-MS/MS method 2014-04-19 发布 2014-06-19 实施 辽宁省质量技术监督局 发 布 DB21/T 22882014 I 前 言 本标准是按照GB/T 1.12009给出的规定起草的。本标准由大连市水产技术推广总站提出。本标准由大连市质量技术监督局归口。本标准起草单位：大连市水产技术
2、推广总站。本标准主要起草人：张秀妍、李勃、丁勇、马琳、郝佳、王骏。DB21/T 22882014 1 养殖水体中孔雀石绿残留量的测定 液相色谱串联质谱法 1 范围范围 本标准规定了养殖水体中孔雀石绿残留量的测定-液相色谱串联质谱法的原理、试剂、仪器设备、测定步骤、结果计算、检出限、回收率和精密度。本标准适用于渔业生产养殖水体中孔雀石绿残留量的测定。本方法的检出限为0.05g/L。2 规范性引用文件规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验
3、室用水规格和试验方法 3 原理原理 样品中的孔雀石绿用乙腈和二氯甲烷液液萃取，反相色谱柱分离，质谱检测器检测，内标法定量。4 试剂试剂 4.1 乙腈：色谱纯。4.2 二氯甲烷。4.3 无水乙酸铵。4.4 甲酸。4.5 甲酸溶液1+1000:准确吸取 1.00mL 甲酸溶于 1000mL 水中，经 0.22m 混合纤维素滤膜过滤。4.6 乙酸铵缓冲溶液5mmol/L：称取 0.385g 无水乙酸铵溶解于 1000mL 水中，冰乙酸调 pH 到 4.5。4.7 乙腈-乙酸铵混合溶液（1+1）：500mL 乙腈与 500mL 乙酸铵溶液（4.6）超声混合 5min。4.8 盐酸羟胺。4.9 盐酸羟胺
4、溶液0.25g/mL：称取 25g 盐酸羟胺溶于 100mL 水中。4.10 对-甲苯磺酸。4.11 对-甲苯磺酸溶液1.0mol/L：称取 17.2g 对-甲苯磺酸，用水溶解，并定容至 100mL。4.12 标准品：孔雀石绿（MG）、氘代孔雀石绿（D5-MG），纯度98%。DB21/T 22882014 2 4.13 标准储备溶液。4.13.1 孔雀石绿标准储备溶液1.0mg/mL：准确称取 10.00mg 的孔雀石绿标准品，用乙腈配制成1.0mg/mL 的标准储备溶液，18避光保存，保存期 3 个月。4.13.2 氘代孔雀石绿标准储备溶液1.0mg/mL：准确称取 10.00mg 的氘代孔
5、雀石绿标准品，用乙腈配制成 1.0mg/mL 的标准储备溶液，18避光保存，保存期 3 个月。4.14 孔雀石绿标准工作溶液100ng/mL、10.0ng/mL：准确吸取孔雀石绿标准储备溶液（4.13.1），用乙腈逐级稀释配成 100ng/mL 和 10.0ng/mL 的工作溶液，18避光保存，保存期 7 天。4.15 氘代孔雀石绿标准工作溶液100ng/mL：准确吸取氘代孔雀石绿标准储备溶液（4.13.2），用乙腈逐级稀释配成 100ng/mL 的工作溶液，18避光保存，保存期 7 天。注：除非另作说明，本方法所用试剂均为分析纯，试验用水符合 GB/T 6682 一级水指标。5 仪器和设备仪
6、器和设备 5.1 高效液相色谱-串联质谱联用仪。5.2 电子天平：感量 0.01mg。5.3 旋转蒸发仪。5.4 旋涡振荡器。5.5 超声波振荡器。6 测定步骤测定步骤 6.1 样品处理 6.1.1 吸取水样 50.00mL，置于 250mL 分液漏斗中。向分液漏斗中加入 20.0L 氘代孔雀石绿标准工作溶液（4.15）、1.5mL 盐酸羟胺溶液（4.9）、2.5mL 对-甲苯磺酸溶液（4.11），振摇混匀。6.1.2 加入 10.0mL 乙腈、25.0mL 二氯甲烷，剧烈振摇 3min，静置分层 10min，将下层溶液转移至 125mL鸡心瓶中。6.1.3 继续向分液漏斗中加入 10.0mL
7、 乙腈、25.0mL 二氯甲烷，剧烈振摇 3min，静置分层 10min，合并下层溶液于上述 125mL 鸡心瓶中，于 452水浴中减压浓缩至近干。6.1.4 向鸡心瓶中加入 1.00mL 乙腈-乙酸铵混合溶液（4.7），涡旋振荡 1min、超声振荡 1min，样液经 0.22m 针孔式有机相滤膜过滤后供高效液相色谱-串联质谱联用仪测定。6.2 空白试验 准确量取 50.00mL 不含孔雀石绿的水样，按样品处理步骤进行。6.3 测定 DB21/T 22882014 3 6.3.1 色谱条件 6.3.1.1 色谱柱：C18柱，100mm3.0mm（内径），粒度 1.8m。6.3.1.2 流动相：
8、乙腈甲酸水溶液（0.1%）=60+40（V/V）。6.3.1.3 流速：0.25mL/min。6.3.1.4 柱温：35。6.3.1.5 进样量：10L。6.3.2 质谱条件 6.3.2.1 离子源：电喷雾 ESI 源，正离子模式。6.3.2.2 扫描方式：多反应监测 MRM。6.3.2.3 雾化气压力：40psi。6.3.2.4 雾化气温度：350。6.3.2.5 雾化气、干燥气为高纯氮气，气体流量：10L/min。6.3.2.6 碰撞气为高纯氮气，气体压力：0.15MPa。6.3.2.7 监测离子对：孔雀石绿 m/z 329/313、329/208；氘代孔雀石绿 m/z 334/318。6
9、.4 标准曲线的配制 检测前，吸取孔雀石绿标准工作溶液（4.14）、氘代孔雀石绿标准工作溶液4.15适量，用流动相配制成浓度分别为 0.01ng/mL、0.05 ng/mL、0.10 ng/mL、0.50 ng/mL、1.00 ng/mL、2.00 ng/mL、5.00 ng/mL 的混合标准系列工作溶液，每毫升该溶液含有氘代孔雀石绿 2.0ng。将此混合标准系列工作溶液按 6.3 的仪器条件测定，孔雀石绿以氘代孔雀石绿为内标物，通过仪器工作站制定内标法标准曲线。6.5 定性依据 在同样测试条件下，阳性样品保留时间与标准物质保留时间相对标准偏差在5%以内，且检测到的离子的相对丰度，用与最强离子
10、（基峰）的强度百分比表示，应当与浓度相当的校正标准相对丰度一致。6.6 定量测定 将样品制备液按 6.3 测定，通过仪器工作站计算制备液中孔雀石绿的浓度。在上述条件下，标准溶液中孔雀石绿、氘代孔雀石绿的参考保留时间分别为 2.203min、2.184min，标准溶液的色谱图及质谱图参见附录 A。7 结果计算结果计算 DB21/T 22882014 4 7.1 制备液中孔雀石绿的浓度 Ci 由仪器工作站依据内标法标准曲线自动计算。7.2 样品中孔雀石绿的含量按式（1）计算。计算结果需扣除空白值。21VVCiXi=（1）式中：Xi样品中孔雀石绿的含量，单位为微克每升（g/L）；Ci制备液中孔雀石绿
11、的浓度，单位为微克每升（g/L）；V1最终定容体积，单位为毫升（mL）；V2样品体积，单位为毫升（mL）。8 检出限检出限 孔雀石绿的检出限为0.05g/L。9 回收率和精密度回收率和精密度 孔雀石绿添加浓度为0.05 g/L5.00g/L时，回收率为80%110%。本方法的批内相对标准偏差小于10%，批间相对标准偏差小于15%。DB21/T 22882014 5 A A 附 录 A（资料性附录）孔雀石绿和氘代孔雀石绿标准溶液的色谱图和质谱图 图A.1 孔雀石绿和氘代孔雀石绿标准溶液的色谱图 图A.2 孔雀石绿标准溶液的质谱图 DB21/T 22882014 6 图A.3 氘代孔雀石绿标准溶液的质谱图 _
