TR3相互作用新蛋白机理研究.pdf

1、 申请代码：C0709 受理部门：收件日期：受理编号：国家自然科学基金 申 请 书 国家自然科学基金 申 请 书(2 0 0 8 版)(2 0 0 8 版)资助类别：面上项目 亚类说明：附注说明：项目名称：TR3 相互作用新蛋白机理研究 申 请 者：吴乔 电话：0592-2187959 依托单位：厦门大学 通讯地址：福建省厦门市思明区思明南路 422 号厦门大学生物二馆 322室 邮政编码：361005 单位电话：0592-2181680 电子邮件： 申报日期：2008年3月8日 国家自然科学基金委员会 30853459 国家自然科学基金申请书 2008 版 第 2 页 版本 1.002.16

2、4 基本信息基本信息 x1xyymUc 姓名 吴乔 性别女 出生年月1959 年 5 月 民 族 汉族 学位 博士 职称教授 主要研究领域细胞信号转导与调控；蛋白质相互作用 电话 0592-2187959 电子邮件 传真 0592-2086630 个 人 网 页 工 作 单 位 厦门大学/生命科学学院 申 请 者 信 息 申 请 者 信 息 在研项目批准号30630070,30570936 名称 厦门大学代 码 36100502 联系人 方俊金 电子邮件 依托单位信息 依托单位信息 电话 0592-2181680 网站地址 http:/ 单 位 名 称 代 码 合作单位信息 合作单位信息 项目

3、名称 TR3相互作用新蛋白机理研究资助类别 面上项目 亚 类 说 明 附注说明 申请代码 C0709:细胞信号转导 C050103:生物大分子相互作用 基地类别 预计研究年限 2009 年 1 月 2011 年 12 月 研究属性 基础研究 项 目 基 本 信 息项 目 基 本 信 息 申请经费 39.0000 万元 摘 要(限 400 字)：摘 要(限 400 字)：TR3 是一种孤儿受体，其特异性配体至今未被确定。但是 TR3 可以通过与其它蛋白的相互作用发挥不同的生物学功能。我们以 TR3 为靶点，通过 GST-pull down 和质谱分析的方法，确定了一个与 TR3 相互作用的新蛋白

4、。进一步的预实验表明新蛋白能够通过TR3 介导调节 p53 的转录活性，提示可能存在一条调控 p53 生物学功能的信号转导新途径。为此，在本课题研究中我们将深入研究新蛋白与 TR3 相互作用的分子机理，分析 TR3 介导的调节 p53 的生物学功能及其信号通路。希望通过研究，能够阐明 TR3 与不同的蛋白相互作用而发挥不同的生物学功能，从而丰富我们对孤儿受体在体内的生理性调节作用的认识，为阐明新的信号途径提供理论依据。关 键 词关 键 词(用分号分开，最多 5 个)孤儿受体 TR3；蛋白质相互作用；p53；信号转导 国家自然科学基金申请书 2008 版 第 3 页 版本 1.002.164 项

5、目组主要成员项目组主要成员（注:项目组主要成员不包括项目申请者，国家杰出青年科学基金类项目不填写此栏。）编号 姓 名 出生年月 性别职 称 学 位 单位名称 电话 电子邮件 项目分工 每年工作时间（月）1 陈航姿1980-12-19 男 博士生 学士 厦门大学 0592-2187959 蛋白作用机理研究 10 2 赵必星1980-11-09 男 博士生 硕士 厦门大学 0592-2187959 heady_ 蛋白作用机理研究 10 3 占艳艳1982-11-1 女 博士生 学士 厦门大学 0592-2187959 hatty_ 蛋白修饰 10 4 姚路明1982-11-23 女 博士生 学士

6、厦门大学 0592-2187959 蛋白修饰 10 5 罗杰1983-11-25 男 硕士生 学士 厦门大学 0592-2187959 细胞学实验 10 6 杜晓丹1984-12-24 女 硕士生 学士 厦门大学 0592-2187959 dodie_ 载体构建 10 7 王渊1984-10-23 女 硕士生 学士 厦门大学 0592-2187959 载体构建 10 8 9 总人数 高级 中级 初级 博士后 博士生 硕士生 8 1 0 0 0 4 3 说明:高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生人员数由申请者负责填报（含申请者），总人数自动生成。国家自然科学基金申请书 2008 版 第 4

7、页 版本 1.002.164 经费申请表经费申请表 （金额单位：万元）科目 申请经费 备注（计算依据与说明）一.研究经费 一.研究经费 31.7000 1.科研业务费 13.3000 （1）测试/计算/分析费 3.0000测试费（2）能源/动力费 2.0000水电费（3）会议费/差旅费 1.3000参加学术会议 3 次（4）出版物/文献/信息传播费 5.0000论文发表费和彩照费（5）其它 2.0000不可预见 2.实验材料费 16.0000 （1）原材料/试剂/药品购置费 11.0000生化试剂，细胞培养基，检测试剂盒，抗体，塑料器皿等（2）其它 5.0000转基因小鼠的构建及其繁殖和饲养

8、3.仪器设备费 2.4000 （1）购置 2.4000电脑，微量移液枪，冰箱，台式离心机（2）试制 4.实验室改装费 5.协作费 二.国际合作与交流费 二.国际合作与交流费 0.0000 1.项目组成员出国合作交流 2.境外专家来华合作交流 三.劳务费 三.劳务费 5.5000用于研究生科研补贴（15）四.管理费 四.管理费 1.80005%合 计 合 计 39.0000 国家其他计划资助经费 其他经费资助（含部门匹配）与本项目相关的 其他经费来源 其他经费来源合计 其他经费来源合计 0.0000 国家自然科学基金申请书 2008 版 第 5 页 版本 1.002.164 报告正文 报告正文

9、立 项 依 据 立 项 依 据 核受体 TR3（也称为 Nur77 或 NGFIB）为孤儿受体(orphan receptor)，其特异性配体至今尚未确定，属于类固醇/甲状腺激素/视黄素受体超家族成员。TR3 具备核受体典型结构特征：N-端是转录激活区，中部为高度保守的 DNA 结合区，含有 2 个锌指结构，C-端为配体结合区，调节 TR3 在细胞中的定位和转录活性。TR3 作为核转录因子，通过外界因子的激活，可以正向或反向调节相关基因表达，由此调控细胞生长、分化和凋亡。TR3 是一种“立早基因”，可以被许多生长刺激因子，包括生长因子、佛波酯和依赖于 cAMP 途径的因子等通过完全不同的途径而

10、诱导表达。例如，通过 TCR（T 细胞抗原受体）激活 B 和 T 细胞可以上调 TR3 mRNA 表达，在成纤维细胞中血清也可以诱导 TR3 mRNA 表达。有趣的是，稳定表达 TR3 能够诱导细胞凋亡，而瞬时表达 TR3 则不能够诱导细胞凋亡。TR3 除了自身转录活性被调节外，还可以作为一个转录调节因子调控其他核受体。我们前期的研究发现了 TR3 自身不仅能够形成同源二聚体，而且还能够与视黄素受体 RXR形成异源二聚体并结合到视黄酸应答元件上发挥转录因子的作用（吴乔等，Mol.Cell.Biol，1997），或者与另一孤儿受体 COUP-TF 相互作用而抑制对方结合到视黄酸应答元件上，由此调

11、控肿瘤细胞对视黄素抑制作用的敏感性（吴乔等，EMBO J,1997）。可见，TR3 可以通过与其他核受体的相互作用而介导不同激素的信号转导过程。1994年在Nature杂志上首次报道了在转录调控水平上TR3参与细胞凋亡的诱导过程。过量表达负显性TR3蛋白或者通过反义TR3表达载体抑制TR3表达等都可以抑制TCR诱导的细胞凋亡，而正常表达 TR3 则可诱导细胞凋亡。这些结果清楚地表明 TR3 在 TCR诱导的细胞凋亡中具有重要作用。TR3 参与细胞凋亡的诱导在其它肿瘤细胞中也观察到。用 AHPN/CD437 处理肺癌细胞，可以有效地诱导细胞凋亡，同时伴随着 TR3 的快速表达，通过反义 TR3

12、抑制其表达可以显著地抑制 AHPN/CD437 诱导的细胞凋亡。我们课题组和其他课题组相继发现了另一条通过 TR3 介导的诱导细胞凋亡新途径：在肿瘤细胞中，依 国家自然科学基金申请书 2008 版 第 6 页 版本 1.002.164 赖 TR3 诱导的细胞凋亡与 TR3 的 DNA 结合和转录活性的激活实际上并没有直接的相关性，但是与 TR3 蛋白在细胞中转运及定位密切相关（吴乔*等,Carcinogenesis,2002）。这是一条全新的通过诱导核转录因子转运到线粒体来调控细胞凋亡的重要途径，并且TR3 蛋白的核浆转运与其对凋亡相关蛋白如 Bcl-2、Bcl-xl 和 Bax 表达水平的调

13、节密切相关（吴乔*等，IJBCB,2004）。更重要的是，我们发现，在这一诱导细胞凋亡的新途径中视黄酸受体 RXR扮演了重要的作用：RXR可以作为分子载体（carrier）协助 TR3 转运，而且这种转运是 RXR 配体依赖性（吴乔*等，Journal of Cell Science，2004）。因此，这些研究从蛋白转运的水平上较好地阐明了 TR3 线粒体定位和诱导细胞凋亡以及TR3 与其他核受体之间的相关性。蛋白质相互作用研究是揭示蛋白质功能、阐释生命现象奥秘的重要手段。生物体中大多数蛋白质都不是孤立存在的，而是在相互联系、相互制约的过程中形成复杂的蛋白质连锁网络，从而发挥其重要的生物学功能

14、和生理活性作用。一些重要的蛋白质或其复合体既是某种特定生理功能的载体，又是各种不同通道之间联系的关键节点。这些作为关键的蛋白质通过相互作用把多个不同生理功能的通路连成一个复杂的网络。深入研究这些复杂性疾病相关蛋白质的定位、转运、翻译后修饰、动态相互作用的机制，认识蛋白质发挥功能的分子基础，将有助于阐明这些疾病的发展规律和发病机制，并在此基础上建立新的防治措施，造福人类。蛋白质在细胞中通常与其它蛋白质相互作用形成大的复合体，在特定的时间和空间中完成特定的生物学功能，而且有些蛋白质的生物学功能只有在复合体形成后才能发挥出来，如依赖于构象变化或翻译后修饰的蛋白质功能。通过蛋白质的相互作用关系，人们才

15、有可能研究细胞中某一生理活动中所有相关蛋白质的变化及作用机制。蛋白质分子之间的动态相互作用与发挥正常生物学功能有着密切的关系。由于各种原因导致蛋白质相互作用的异常在疾病发生中具有重要作用，如信号传导途径的异常和肿瘤发生过程等。p53 是一个非常重要的抑癌蛋白，它的抗肿瘤作用之一就是诱导细胞凋亡。大量研究已经证明 p53 作为一个中心枢纽在细胞信号转导与凋亡调控中发挥重要作用，介导着对肿瘤发生和发展的抑制作用。但是在肿瘤细胞中 p53 蛋白低水平表达，这是由于 MDM2蛋白（一个重要的原癌蛋白）具有泛素酶的作用能够降解 p53 蛋白。反过来，p53 能够激活 MDM2 的转录活性。这是一条很重要

16、的反馈通路，对于肿瘤发生和发展产生关键性 国家自然科学基金申请书 2008 版 第 7 页 版本 1.002.164 的影响。许多研究表明，p53 发挥其重要的生物学功能需要与众多的蛋白相互作用，这其中 p53 具有直接诱导细胞凋亡抑制肿瘤生长的功能，也发挥着架构蛋白的作用，介导其它蛋白对癌蛋白的抑制。我们最近发现，核受体 TR3 对 MDM2 的抑制作用就是由 p53介导的。p53 既与 TR3 结合，也与 MDM2 结合，起着架构蛋白的作用，并且 TR3 与 p53的结合对 TR3 抑制 MDM2 表达是必须的。进一步的研究表明，TR3 通过抑制 p53 的乙酰化，下调 p53 的转录活性

17、，从而在转录水平上抑制了 MDM2。另外，TR3 与 p53 的结合还能够阻断 MDM2 诱导的 p53 泛素化和降解，并且导致 MDM2 自身泛素化和降解。最重要的是 TR3通过对 MDM2 的抑制反过来又能够增强 p53 诱导的肿瘤细胞凋亡。由此表明，蛋白之间的相互作用共同协同/抑制细胞凋亡和肿瘤的发生和发展。因此，我们的研究同时在转录和转录后水平上通过蛋白之间的相互作用揭示了 p53 介导的 TR3 对 MDM2 抑制的分子机制（吴乔*等，The EMBO J,2006）。在研究蛋白相互作用的同时，对于蛋白质翻译后修饰方面的研究也取得重大进展。研究显示它们是相辅相成、密切相关的。许多蛋白

18、的异常翻译后修饰在疾病发生中起着重要的作用。例如 p53 同其他蛋白质一样，翻译后有极为丰富的加工与修饰,p53 的这种修饰是调节 p53 活性与稳定性的重要机制。翻译后修饰使 p53 蛋白呈现功能多样性，可能与某些肿瘤的发生密切相关。p53 的翻译后修饰不是单个位点的修饰而是包括磷酸化、乙酰化、泛素化以及 SUMO 化作用的多位点修饰，另外还有糖基化和核糖基化。蛋白的多位点修饰构成一个复杂的调控体系，使蛋白在相应信号刺激下，通过特定的翻译后修饰，获得某种功能或失去某种功能，从而产生特异性的作用。TR3 是一个极易被磷酸化的转录因子。最近，我们发现了 JNK 激活剂能够通过泛素化途径降解 TR

19、3，并且这个降解过程与 TR3 磷酸化密切相关。进一步的研究表明，JNK通过泛素/蛋白酶体途径促进 TR3 泛素化和降解，而 JNK 磷酸化 TR3 是其诱导 TR3 泛素化的前提。同时，JNK 磷酸化抑制 TR3 与 DNA 应答元件结合，但对 TR3 的转运没有影响。我们还发现 JNK 磷酸化则抑制 TR3 诱导的 DNA 合成，由此抑制细胞增殖。这些研究可能为阐明 JNK 和 TR3 在某些肿瘤发生发展中的作用机理，为筛选特异性药物治疗 TR3 依赖性肿瘤提供了理论依据（吴乔*等，Endocrinology,2007）。重要的是，TR3 不仅被许多蛋白激酶磷酸化，反过来它可以作为一个调节

20、因子调节其它转录因子的蛋白修饰过程。我们发现组蛋白乙酰化酶 p300 能够诱导视黄酸受体 国家自然科学基金申请书 2008 版 第 8 页 版本 1.002.164 RXR乙酰化，从而诱导 RXR结合到 DNA，加强 RXR的转录活性。更重要的是我们确定了孤儿受体 TR3 能够抑制 p300 诱导的 RXR乙酰化，并通过与 RXR的结合，共同转运到线粒体，从而触发细胞凋亡（吴乔*等，Molecular Endocrinology,2007）。更深入的研究证明 TR3 调控许多转录因子的乙酰化是通过与 p300 的相互作用，抑制 p300 组蛋白乙酰化酶的活性，从而阻断 p300 对其它转录因子

21、乙酰化的能力（吴乔*等，Nuclei Acids Research,2007）。综上所述，TR3 通过与众多的蛋白相互作用，参与了多种信号通路的调节，对细胞生长和凋亡具有重要的意义。我们课题组多年来一直进行蛋白的相互作用研究，并主要集中在 TR3 相互作用新蛋白的发现、鉴定及其生物学功能和信号通路的研究。为了更好地开展蛋白相互作用的研究，我们不仅以 TR3 为诱饵蛋白进行了酵母双杂交实验，而且以 TR3 为靶点利用 GST-pull down 和质谱分析的方法，从中发现了许多未见报道的与 TR3相互作用的蛋白。Ku80 就是其中的一个蛋白。Ku80 是一个 ATP-dependent DNA

22、helicase（即解旋蛋白），广泛存在于哺乳动物细胞内,最初在多肌炎硬皮病重叠综合征病人体内作为自身抗原被发现。Ku 蛋白是一个约 69kDa 和 83kDa 多肽组成的二聚体 ku70/ku80。1994 年，Tuteja 等发现 Ku 蛋白具有 DNA 依赖的 ATPase 酶和解旋酶活性，Ku 同源分子DNA 解旋酶能在 DNA 链上由 35方向移动，解开 DNA 双链，从而使复制叉移动。重要的是，Ku 蛋白作为调节亚单位，能够与催化亚单位 DNAPK（DNA-dependent protein kinase）相互作用。一旦 Ku 与 DNA 末端结合即可恢复与之结合的催化亚单位(DN

23、A-PKcs)的活性,使 DNA-PK 酶活性启动。在本课题中，我们将进行 TR3DNA-PK 和 TR3-Ku80 相互作用及其信号调控途径的研究。在预实验中，我们不仅证实了 TR3 能够与 DNA-PK 和 Ku80 结合，更重要的是发现了通过 DNA-PK 的介导，TR3 能够提高肿瘤抑制因子 p53 的转录活性。这些发现都是前人没有报道过的，开展相关研究具有很好的原创性。因此，我们拟在本课题研究中进行相互作用分子机理的研究，分析 DNA-PK 和 Ku80 对 TR3 调节的信号通路，以及所产生的生物学效应，包括对 p53 蛋白生物学功能的调控及其所介导的细胞凋亡和细胞衰老。同时，我们

24、还将在基因敲除的小鼠中进一步证实细胞实验模型。我们希望通过研究，能够阐明TR3 通过与不同的蛋白相互作用而发挥不同的生物学功能，从而丰富我们对孤儿受体在体内的生理性调节作用的认识，为阐明新的信号途径提供理论依据。国家自然科学基金申请书 2008 版 第 9 页 版本 1.002.164 主要参考文献 1,B Lin,et al.,Cell,2004,116:527-540 2,YP Zhang,et al.,Science,2001,292:1910-1915 3,H Srinivas,et al.,Mol.Cell.Biol.,2005,25:1054-1069 4,Y Katagiri,e

25、t al.,Nature Cell Biology,2:435-440 5,H Li,et al.,Science,2000,289:1159-1164 6,S Kolluri,et al.,Mol.Cell.Biol.,2003,23:8651-8667 7,N Masuyama,et al.,J.Biol.Chem.,2001,276:32799-32805 8,X Cao,et al.,Mol.Cell.Biol.,2004,24:9705-9725 9,Momand J,et al.,Cell,1992,69:1237-1245 10,Oliner JD,et al.,Nature,1

26、992,358:80-83 11，Haupt Y,et al.,Nature,1997,387:296-299 12,Kubbutat MHC,et al.,Nature,1997,387:299-303 13,Q Wu(吴乔),et al.,The EMBO J,1997,16:1656-1669 14,Q Wu(吴乔),et al.,Mol.Cell.Biol.,1997,17:6598-6608 15,Q Wu*(吴乔),et al.,Cargenogenesis,2002,23:1583-1592 16,Xiao-feng Lin,Q Wu*(吴乔),et al.,J.Cell Sci

27、ence,2004,117:5609-5621 17,Bi-Xing Zhao,Q Wu*(吴乔),et al.,The EMBO J,2006,25:5703-5715 18,Bo Liu,Q Wu*(吴乔),et al.,Endocrinology,2007,148:34-44 19,Wen-xiu zhao,Q Wu*(吴乔),et al.,Molecular Endocrinology,2007,21:2877-2889.20,Gui-deng Li,Q Wu*(吴乔),et al.,Nucleis Acid Research 2007,35:7348-7359.21,T Mimori

28、,et al.,J Clin Invest,1981;68:611-620 22,N Tuteja,et al.,EMBO J,1994;13:4991-5001.国家自然科学基金申请书 2008 版 第 10 页 版本 1.002.164 研究内容、研究目标以及拟解决的关键问题 研究内容、研究目标以及拟解决的关键问题 研究内容 研究内容 最近，我们通过 GST-pull down 和质谱分析的方法发现了与 TR3 相互结合的新蛋白Ku80（图 1）。Ku 蛋白是由调节亚基 Ku70/Ku80 和催化亚基 DNA-PK（DNA-dependent protein kinase）组成的。预实验结

29、果表明，TR3 不仅与 Ku80 结合，还与 DNA-PK 结合（图 2）。由于 DNA-PK 作为蛋白激酶参与了 p53 的磷酸化，因此 TR3 与之结合可能影响到 p53 的生物学功能。我们进一步的预实验也证实，TR3 能够通过 DNA-PK 的介导提高p53 的转录活性（图 3）。在我们已经发表的论文中，我们发现了 TR3 能够提高 p53 介导的细胞凋亡（Zhao,et al.,The EMBO J,2006），这其中 TR3 参与调控的分子机理及其信号调控途径仍然不清楚。因此，深入开展这项课题的研究有可能阐明 TR3 是如何调节 p53 转录活性，促进其诱导细胞凋亡的新机制。为此，我

30、们将开展以下的具体研究工作：一，DNA-PK 诱导 TR3 蛋白表达的机理 一，DNA-PK 诱导 TR3 蛋白表达的机理 我们发现，DNA-PK 能够诱导 TR3 蛋白表达，并且随着 DNA-PK 转染量的增加，TR3蛋白表达也不断提高，呈现正相关的趋势（图 4）。那么，为什么 DNA-PK 具有这种诱导功能呢？由于 DNA-PK 是一种蛋白激酶，TR3 又是一种极易被磷酸化的蛋白。那么我们设想，是否 DNA-PK 能够磷酸化 TR3 呢？为此，我们将构建 TR3 一系列突变体，包括缺失突变体和点突变体，来确定 DNA-PK 磷酸化 TR3 的可能位点，分析是否由于 DNA-PK 的磷酸化而

31、诱导 TR3 蛋白表达水平的提高，探讨 DNA-PK 通过相互作用调节 TR3 的机理。二，DNA-PK-TR3-p53 的信号转导新途径及其生物学功能研究 二，DNA-PK-TR3-p53 的信号转导新途径及其生物学功能研究 我们前期研究表明 TR3 能够通过与 p53 的相互作用抑制其乙酰化的活性（Zhao,et al.,The EMBO J,2006）。结合我们最近的预试验TR3 能够通过 DNA-PK 的介导提高p53 的转录活性（图 3），我们推测 DNA-PK 磷酸化 TR3 后，可能引起 TR3 抑制 p53 乙酰化功能的改变。为此我们将分析 DNA-PK 存在下，TR3 如何调

32、节 p53 的功能，包括乙酰化、转录激活、p53 介导的细胞凋亡等。同时利用上面确定的与 DNA-PK 磷酸化相关的 TR3 国家自然科学基金申请书 2008 版 第 11 页 版本 1.002.164 突变体进一步确定是否通过 DNA-PK 的磷酸化，TR3 能够调控 p53 的生物学功能。通过研究，我们可能发现一条通过 DNA-PK 磷酸化 TR3 来调节 p53 诱导细胞凋亡的信号转导新途径。三，Ku80 对 TR3 的调控机理 三，Ku80 对 TR3 的调控机理 由于 Ku80 能够与 TR3 结合（图 2），我们将研究它们结合所产生的生物学效应。如同 DNA-PK 那样，Ku80

33、也能够上调 TR3 蛋白的表达水平（图 5）。但是 Ku80 不是蛋白激酶，不能磷酸化 TR3，那么它的调控机理是什么呢？我们将分析 Ku80 诱导 TR3 堆积是否与其减缓 TR3 自身降解有关。Ku80 作为 DNA-PK 的调节亚基，我们也将研究 Ku80 是否通过 DNA-PK 来影响 TR3 的蛋白表达水平。我们的预实验还表明，TR3 与 Ku80 共定位于细胞核内（图 6）。他人的研究表明 Ku80 分子具有核定位序列，对于与之相结合的蛋白入核非常重要。那么，TR3 的入核是否与 Ku80 有关呢？它们之间存在什么样的关系？我们将通过构建不同的 Ku80 缺失突变体，通过核浆定位分

34、析来阐明这个问题。四，Ku80-TR3-p53 的信号转导新途径及其生物学功能研究 四，Ku80-TR3-p53 的信号转导新途径及其生物学功能研究 由于已有报道指出 Ku 蛋白参与了端粒酶的调控，从而引起细胞衰老。在小鼠中如果将 Ku80 基因敲除就会诱发衰老。那么 TR3 与 Ku80 的结合是否影响 Ku80 介导的端粒酶和细胞衰老？联系 Ku80 通过结合提高 TR3 表达，那么是否能够促进 TR3 更好的结合到 p53 分子，从而通过 p53 介导诱导细胞衰老？是否还有其它因子参与这个过程？这些问题都是非常有意思的，而且也很重要。我们希望通过这些问题的研究，能够发现 Ku80TR3p

35、53 诱导细胞衰老的信号途径。五，细胞内 TR3，Ku80 和 DNA-PK 的动态调节 五，细胞内 TR3，Ku80 和 DNA-PK 的动态调节 在肿瘤细胞内这三种蛋白均普遍表达,而且相互结合（图 2）。那么，它们在细胞内如何相互调节、相互协同地发挥作用呢?它们是否处于一种动态调节的过程呢？为了回答这些问题，首先，我们将分析 Ku80 和 DNA-PK 与 TR3 的亲和力，确定它们在细胞内可能存在的结合形式：是三聚合体的结合形式还是二聚体的结合形式；其次，我们将分析过量表达 Ku80 或 DNA-PK 是否影响对方与 TR3 结合；再者，我们将构建 Ku80 和 DNA-PK的 siRN

36、A 抑制内源性蛋白的表达，从而证实它们之间存在的动态调节。最后，我们将 国家自然科学基金申请书 2008 版 第 12 页 版本 1.002.164 进一步分析动态调节是否影响 TR3 对 p53 功能的影响，从而确定三者之间的调节与被调节、作用与被作用的关系。六，TR3DNA-PK 和 TR3Ku80 信号通路在基因敲除小鼠体内的作用 六，TR3DNA-PK 和 TR3Ku80 信号通路在基因敲除小鼠体内的作用 如果我们以上的实验证实了细胞内存在 TR3DNA-PK 和 TR3-Ku80 的信号通路，那么我们将在TR3基因敲除小鼠中进一步证实这些信号通路的存在对小鼠生存所产生的生理性影响。我

37、们课题组目前已经拥有了 TR3 基因敲除小鼠。我们将建立转 Ku80 或 DNA-PK基因（gene transgenic）的小鼠,与 TR3 野生型或基因敲除型小鼠杂交，观察 TR3 表达/敲除以及 Ku80 和 DNA-PK 过表达对小鼠生存的影响。我们还将分析在这些转基因小鼠中是否对 p53 基因表达有影响？是否对小鼠的衰老产生影响？通过研究，有望阐明 TR3，DNA-PK 和 Ku80 的生理性新功能，及其对 p53 的调节功能。研究目标 研究目标 1，以 DNA-PK 磷酸化 TR3 为主轴，探讨 TR3-DNA-PK 相互作用的分子机理。全面系统地分析 DNA-PK 通过诱导 TR

38、3 磷酸化调控 p53 介导的细胞凋亡的现象，探讨引起这种现象的根本原因，阐明 DNA-PK-TR3-p53 的信号转导新途径。2，分析 Ku80 与 TR3 相互作用所产生的生物学效应，确定 Ku80 是否影响 TR3 的核定位。探讨 TR3 是否参与 Ku80 介导的 p53 对端粒活性的调节，与 p53 诱导的细胞衰老相联系，阐明 Ku80-TR3-p53 的信号转导新途径。3，分析 TR3、Ku80 和 DNA-PK 在细胞内的动态调节过程以及它们之间的相互关系，确定三者之间的调节与被调节、作用与被作用的关系。4，探讨 TR3 在体内通过 DNA-PK 和 Ku80 调节引起的生理性功

39、能的变化，揭示 TR3、DNA-PK 和 Ku80 的生理新功能。拟解决的关键问题 拟解决的关键问题 1，确定 TR3 是否通过 DNA-PK 的磷酸化调节 p53 的生物学功能。2，确定 TR3 是否通过 Ku80 的介导参与 p53 对端粒的调节。3，确定 TR3、Ku80 和 DNA-PK 在体内的动态调节及其生理新功能。国家自然科学基金申请书 2008 版 第 13 页 版本 1.002.164 拟采取的研究方案及可行性分析 拟采取的研究方案及可行性分析 研 究 方 案 研 究 方 案 以分子细胞生物学手段开展研究。根据需要构建不同的缺失突变体和点突变体；通过磷酸钙沉淀方法，将不同的表

40、达载体转染细胞；免疫沉淀/Western blot 和 GST pull down 等分析蛋白之间的相互作用；凝胶阻抑实验分析蛋白与 DNA 结合状态；Luciferase活性测定基因应答元件转录水平；免疫荧光标记和激光共聚焦显微术观察蛋白转运和定位过程；Western blot 分析蛋白表达水平；流式细胞术检测细胞凋亡，SA-gal 方法检测细胞衰老等等。以上的研究方案将有助于探讨 TR3 与 DNA-PK 和 Ku80 的相互作用机理以及相关的信号转导调控。技 术 路 线 技 术 路 线 TR3 与 Ku80 和 DNAPK 相互作用的研究技术路线图 TR3 与 Ku80 和 DNAPK

41、相互作用的研究技术路线图 国家自然科学基金申请书 2008 版 第 14 页 版本 1.002.164 实 验 方 法 1，免疫荧光标记和激光显微镜观察实 验 方 法 1，免疫荧光标记和激光显微镜观察：细胞培养在玻片上，用多聚甲醛固定，固定后与一抗孵育过夜，再与相应的连接荧光染料的二抗孵育 34 小时，以显示所要观察的蛋白。激光共聚焦显微镜观察蛋白的分布和转运过程。2，免疫共沉淀 2，免疫共沉淀:收集细胞，加入适量裂解液 ELB 于冰上裂解细胞 30 分钟，离心（15000rpm）30 分钟，取上清液测定蛋白浓度。加入 protein A（Santa Cruz）和相应抗体（Santa Cruz

42、）与待检蛋白孵育孵育 4 小时（4C），离心（3000rpm，4C）5 分钟，倾去上清，沉淀部分用 PBS 洗三次，离心（15000rpm）30 秒后吸净残留的 PBS，加入 40ul 上样缓冲液悬浮，沸水浴 5 分钟，离心（15000rpm）30 秒，上清用于电泳。3，Western blot 测定蛋白表达水平 3，Western blot 测定蛋白表达水平：按常规制备细胞裂解液，在 SDS-PAGE 胶上电泳，蛋白转膜后与相应抗体孵育，ECL 试剂盒显示蛋白。如果要测定蛋白磷酸化，则用相应的磷酸特异性抗体。4，GST Pull Down 实验：4，GST Pull Down 实验：将吸附在

43、 GS-4B beads 上的与 GST 融合的体外翻译蛋白在Binding beffer 中孵育，离心，将 beads 重悬于 SDS-PAGE 上样缓冲液，并进行 SDS-PAGE电泳，电转，与体外翻译蛋白相应的一抗、二抗（HRP）孵育，之后进行曝光显影。5，磷酸钙沉淀法转染表达载体 5，磷酸钙沉淀法转染表达载体：通过磷酸钙沉淀法将所需的表达载体转染到细胞中，36 小时后收集细胞或用所需的试剂处理细胞，供其他实验所用。6，Luciferase 活性测定：6，Luciferase 活性测定：将带报告基因 NurRE-luc 的质粒转染细胞，36 小时后收集并裂解细胞。然后将装有细胞裂解液的小

44、管置于荧光光子测定仪中，并加入荧光素酶荧光素反应液，即刻测定反应液加样品后 2 分钟内释放的光子量，以示荧光酶活性。7，凝胶阻抑实验：7，凝胶阻抑实验：按常规方法提取核蛋白，与生物标记的寡核苷酸孵育，PAGE凝胶电泳，电转到尼龙膜后，与生物素抗体孵育后显影。国家自然科学基金申请书 2008 版 第 15 页 版本 1.002.164 8，流式细胞术检测细胞凋亡8，流式细胞术检测细胞凋亡：细胞制备成单细胞悬液，迅速加入预冷的 70乙醇，4固定过夜，PBS 离心洗两次，调整细胞浓度为 106/ml，加入 RNA 酶(50ug/ml)，37孵育 30min，加入 PI（20 g/ml）4孵育 30

45、min，PBS 洗涤后上机检测。9，SA-9，SA-gal 方法检测细胞衰老-gal 方法检测细胞衰老：移去细胞培养液，PBS 洗涤三次，加入固定液（2甲醛，0.2戊二醛）室温固定细胞 35 min，再用 PBS 洗两遍。加入染色液（K3Fe(CN)6 5mM,K4Fe(CN)6 5mM,MgCl2 2mM,NaCl 150mM,Citric Acid/Phosphate Buffer 30mM,X-Gal 1mg/ml,pH=6）37 孵育 24h。PBS 洗两次，于显微镜下观察。可行性分析 1，立项申请的基础：可行性分析 1，立项申请的基础：从 1995 年开始，申请者就进行孤儿受体 TR

46、3 功能的系列研究。特别是近年来申请者领导的实验室主要集中在 TR3 相互作用蛋白、蛋白修饰和转运等研究方向上，在国际刊物上已经发表相关论文多篇（请参见申请书的“研究基础”）。更重要的是，本项目的研究内容又是在近年来已经取得了先期成果的基础上提出的，并且对于一些关键的科学假设均有前期预实验作为依据（请参见申请书的“研究基础”）。因此，从课题的选择到课题的立项均具有较为充分的依据、一定的深度和较好的创新性，这对于顺利地完成课题研究是至关重要的。2，各种表达质粒：2，各种表达质粒：由于申请者实验室近年来一直从事孤儿受体 TR3 研究，因此相关的 deletion mutant、siRNA 和 do

47、minant negative expression vector 等已经构建成功。另外，实验室特别注重与国外实验室的交流和联系，已经获得了本课题研究必需的相关质粒，如 DNA-PK 等。同时，我们也通过 RT-PCR 方法获得了 Ku80 基因，并构建在不同的表达载体上。这些先期工作为本课题的申请和后续工作的完成提供了极为关键的实验保证。3，实验技术3，实验技术：课题中拟采用的实验技术均已在申请者实验室很好地建立并广泛使用，为课题的顺利开展打下了很好的基础。国家自然科学基金申请书 2008 版 第 16 页 版本 1.002.164 本项目的特色和创新之处 本项目的特色和创新之处 研究特色和

48、创新之处 研究特色和创新之处 通过蛋白相互作用机理的研究、阐明信号转导新途径是本课题研究的特色，也是当前细胞分子生物学研究前沿。TR3 与 Ku80 相互结合是我们通过 GST pull down 和质谱分析的方法发现的，进一步的预实验证实 TR3 还能够与 DNA-PK 相互结合，这些蛋白的相互作用以前未见报道。特别是 TR3 能够通过 DNA-PK 的介导调节 p53 的转录活性，提示了在 TR3 和 p53 之间存在着一条重要的信号转导新途径，这些都是一些原创性的发现，但是它们之间的相关性和作用机理仍然需要进一步的研究。因此，深入研究 TR3Ku80和 TR3-DNA-PK 相互作用的机

49、理，探讨它们在信号通路中的作用不仅将有助于阐明孤儿受体的生物学新功能，而且将大大地丰富和完善 p53 介导的细胞凋亡和细胞衰老等重要的生物学理论问题。年度研究计划及预期研究成果 年度研究计划及预期研究成果 年度研究计划 年度研究计划 本课题研究将在三年之内完成。2009.1-2009.12:TR3 与 DNA-PK 相互作用的机理及其对 p53 生物学功能的调控。2010.1-2010.12：TR3 与 Ku-80 相互作用的分子机理以及 TR3 通过 Ku80 介导参与调控的一些生物学重要过程。总结前期阶段性成果，撰写论文。2011.1-2011.12：TR3、DNA-PK 和 Ku80 在

50、体内动态调节及其发挥的生理性功能研究。总结前期阶段性成果，撰写论文；课题总结。预期研究成果 预期研究成果 1，力争完成研究目标中的所有研究内容。2，研究成果力求达到国内领先水平和国际先进水平，在国际本领域重要的 SCI 杂志上发表论文 23 篇，其中有些论文的影响因子超过 5.0，力争超过 10。4，培养若干名博士生和硕士生，使他们的研究水平达到优秀。国家自然科学基金申请书 2008 版 第 17 页 版本 1.002.164 研究基础与工作条件 研究基础与工作条件 研 究 基 础 一，前期成果TR3 与其它蛋白的相互作用、所产生的生物学功能及其科学意义 研 究 基 础 一，前期成果TR3 与